Ba metabolites yina ke sadisaka nitu na kukangama ngolo kele kima ya mfunu ya ke sadisaka nitu na kukangama ngolo (TME), kansi katula kaka mwa bima ya nkaka, bantu me zaba ve mambu mingi ya me tala yo. Awa, beto tadilaka ba tumeur mpi baselile T yina katukaka na ba tumeur mpi na ba ascite ya bambefo yina kele ti kansere ya ngolo (HGSC) sambu na kuzaba mutindu bima yai ya kuswaswana ya TME ke balukaka. Ascite ti baselile ya tumeur ke vandaka ti luswaswanu ya nene na kati ya bima yina ke sobaka nitu. Kana beto fwanisa yo ti maladi ya ntu, baselile T yina ke kotaka na nitu ke vandaka ti baselile mingi ya 1-méthylniconamide (AMN). Ata kiteso ya ADN na baselile ya T ke vandaka mingi, mutindu baselile ya ke basisaka menga (enzyme yina ke sadisaka bimvuka ya methyl na kukatuka na S-adénosylméthionine) ke basikaka kaka na baselile ya fibroblaste mpi na baselile yina ke basisaka menga. Na mutindu ya kisalu, ADN kepusaka baselile T na kubasisa kima mosi ya kesadisaka nitu na kufwa (facteur alpha) yina kesadisaka nitu na kufwa. Yo yina, MNA yina mekatuka na TME kesadisaka na kutanina baselile T mpi yo kemonisaka kima mosi ya lenda sadisa nitu na kubelula kansere ya muntu.
Bima yina ke katukaka na tumeur lenda vanda ti bupusi ya ngolo ya kukanga nitu yina ke nwanaka ti tumeur, mpi banzikisa mingi ke monisa nde yo lenda vanda mpi ngolo ya mfunu yina ke pusaka maladi na kuyela (1). Katula mambu yina Warburg ke salaka, kisalu ya ntama mingi ve me yantika kusala sambu na kuzaba mutindu baselile ya tumeur ke balulaka nitu mpi kuwakana na yo ti mutindu nitu ke taninaka nitu (TME). Bakulonguka yina bo salaka na bifwanisu ya mpuku mpi na baselile ya T ya bantu me monisaka nde, mutindu nitu ke balulaka glutamine (2), mutindu nitu ke balulaka bima yina ke pesaka ngolo (3) mpi sukadi (4) lenda sala mambu na kimpwanza yonso na bimvuka ya fioti ya baselile yina ke taninaka nitu. Bima mingi yina ke basikaka na nitu na banzila yai ke kangaka kisalu ya baselile T yina ke nwanaka ti tumeur. Yau memonisama nde kukangama ya coenzyme tetrahydrobioptérine (BH4) lenda bebisa kuyela ya baselile ya T, mpi kuyela ya BH4 na nitu lenda kumisa ngolo mvutu ya nitu yina kenwanisaka ba tumeur yina kekatukaka na CD4 ti CD8. Diaka, bo lenda gulusa ngolo ya kynurénine yina ke kangaka ngolo ya nitu kana bo pesa muntu BH4 (5). Na glioblastome yina ke balukaka na nitu, kubasika ya bima yina ke sadisaka nitu na kukangama ngolo ke kangaka nzila na kisalu ya baselile T, na kukuma mingi mpi na kisalu ya kufwa baselile (6). Ntama mingi ve, bo me monisaka nde methylglyoxal, yina kele kima mosi ya ke katukaka na glycolyse, ke basikaka na baselile yina ke kangaka menga yina ke katukaka na myéloïde, mpi kana baselile T me pesa methylglyoxal lenda kanga kisalu ya baselile T yina ke salaka kisalu. Na lusansu, kufwa ya methylglyoxal lenda nunga kisalu ya baselile ya kekangaka nzila na myéloïde (MDSC) mpi kusadisa na mutindu mosi ya kufwanana na kutomisa lusansu ya kukanga nzila na bisika ya kutala na bambandu ya bampuku (7). Bakulonguka yai yonso ketubilaka mingi kisalu ya mfunu ya bima yina kekatukaka na TME na kuyidika kisalu mpi bisalu ya baselile ya T.
Bo me tubaka mingi nde baselile T ke salaka ve mbote na kansere ya divumu (8). Yau kekatukaka na ndambu na bikalulu ya mvingu ya bantu yina kevandaka na kati ya kukonda mupepe ya mbote mpi misisa ya nitu yina kele ve mbote (9), yina kesalaka nde sukadi ti tryptophane kubaluka na bima yankaka bonso acide lactic mpi kynurénine. Kuluta mingi ya lactate yina kele na nganda ya baselile ke kulumusaka kisalu ya IFN-γ mpi ke pusaka bimvuka ya fioti yina ke kangaka misisa ya nitu na kuswaswana ( 10, 11 ). Kudya tryptophane ke kangaka mbala mosi kuyela ya baselile T mpi ke kangaka nzila na baselile T yina ke bakaka bansangu ( 12-14 ). Ata mambu yai ya bo me mona, kisalu mingi ya ke tadila mutindu nitu ke taninaka nitu me salama na mutindu ya kukuna baselile T na in vitro na kusadilaka mitindu ya mbote ya kusadila, to kaka na bambandu ya mpuku yina kele kiteso mosi na in vivo, ata mosi ve na kati na yo ke monisa mbote-mbote mutindu kansere ya bantu ke vandaka mpi kisika yina bo ke zingaka.
Kikalulu mosi ya ke monanaka mingi na kansere ya divumu kele kupanzana ya divumu mpi kumonana ya ascite. Kuvukisa masa ya baselile na kati ya ascite ke vandaka na kuwakana ti maladi ya ngolo mpi mambu ya mbi yina lenda salama (15). Na kutadila bansangu, kisika yai ya kuswaswana kele ti mupepe ya kukonda mupepe, yo kele ti bima mingi yina ke sadisaka misisa na kuyela ( VEGF ) mpi bima yina ke sadisaka misisa na kuyela ( IDO ), mpi baselile T yina ke twadisaka misisa mpi baselile yina ke kangaka misisa ke kotaka na kati ( 15-18 ). Kisika yina ascite ke balulaka bima lenda swaswana ti kisika yina tumeur yo mosi ke salaka, yo yina mutindu baselile T ke yidikaka diaka na kisika ya ntulu ke vandaka pwelele ve. Diaka, luswaswanu ya mfunu mpi mambu ya kuswaswana yina kele na kati ya ascite mpi bima yina ke basikaka na nitu yina kele na kisika yina tumeur ke vandaka lenda kanga nzila na kukota ya baselile yina ke taninaka nitu mpi kisalu na yo na tumeur, mpi yo ke lomba kusala bansosa ya nkaka.
Na kumanisa mambu yayi, beto salaka mutindu mosi ya kukabula baselile ya ngolo mpe ya kuzaba mutindu ya kusadila baselile ya masa (LC-MS/MS) samu na kulonguka mitindu ya baselile ya mutindu na mutindu (na kati ya yau baselile CD4 + mpe CD8 + T) mpe na kati mpe na kati ya ba tumeur Ba metabolites na yau ke tambulaka na baselile yina kele na kisika mosi ya ascite mpe ya kisika yina mbefo kele. Beto ke sadilaka metode yai kumosi ti cytométrie ya flux ya nene mpi kulandana ya ARN ya baselile mosi (scRNA-seq) sambu na kupesa kifwanisu ya me yidika mbote-mbote ya kisika ya bima ya ke tambulaka na nitu ya bantu yai ya mfunu. Metode yai monisaka nde kiteso ya 1-méthylniconamide (AMN) kumaka mingi na baselile ya T ya tumeur, mpi bansosa yina bo salaka na vitro monisaka nde bo zabaka ve ntete bupusi ya ADN na yina me tala kisalu ya baselile T. Na kimvuka, metode yai ke monisaka mutindu bima ke vukanaka na kati ya ba tumeur mpi baselile yina ke taninaka nitu, mpi yo ke pesaka mayele ya kuswaswana na yina me tala bima yina ke sadisaka nitu na kutanina nitu, yina lenda vanda mfunu sambu na kusansa maladi ya kansere ya ovaire yina ke sadilaka baselile T Mabaku ya kusansa.
Beto sadilaka cytométrie ya flux ya nene sambu na kuzaba na mbala mosi kiteso ya sukadi yina bo ke bakaka mpi kisalu ya mitokondrie. ba marqueurs ya kifwani yina ke swaswanisaka ba cellules immunitaires na ba baselile ya tumeur (Tableau S2 na Kifwanisu S1A). Kufimpa yai monisaka nde kana beto fwanisa yo ti baselile ya T, baselile ya ascite mpi ya tumeur ke bakaka sukadi mingi, kansi yo ke vandaka ti luswaswanu ya fioti na kisalu ya mitokondrie. Kubaka ya sukadi na baselile ya tumor [CD45-EpCAM (EpCAM)+] kele mbala tatu to iya kuluta baselile ya T, mpi mwayene ya kubaka sukadi ya baselile ya CD4 + T kele mbala 1,2 kuluta ya baselile ya CD8 + T, yina ke monisa nde baselile ya CD8 + T ke bakaka sukadi (TIL ke lombaka TME ya kuswaswana). Na kuswaswana, kisalu ya mitokondrie na baselile ya tumeur kele kiteso mosi ti ya baselile ya CD4 + T, mpi kisalu ya mitokondrie ya mitindu yonso zole ya baselile kele mingi kuluta yina ya baselile ya CD8 + T (Kifwanisu 1B). Na kimvuka, bamvutu yai kemonisaka nivo ya metabolism. Kisalu ya kubalula ya baselile ya tumeur kele mingi kuluta ya baselile ya CD4 + T, mpi kisalu ya kubalula ya baselile ya CD4 + T kele mingi kuluta ya baselile ya CD8 + T. Ata mambu yayi na kati ya mitindu ya baselile, luswaswanu kele ve ya kufwanana na yina metala mutindu ya kusadila bima ya baselile CD4 + mpe CD8 + T to kitezo na bau na kati ya ba ascite kana beto fwanisa yau na ba tumeurs (Kifwanisu 1C). Na kuswaswana, na kitini ya baselile ya CD45, ntalu ya baselile ya EpCAM+ na kati ya tumeur kumaka mingi kana beto fwanisa yo ti baselile ya ntu (Kifwanisu 1D). Beto monaka mpi luswaswanu ya pwelele ya ke tadila mutindu nitu ke balulaka nitu na kati ya bima yina ke salaka baselile ya EpCAM+ mpi ya EpCAM-. Ba cellule ya EpCAM+ (tumeur) kele na ngolo ya kubaka sukadi mpe kisalu ya mitokondrie kuluta ba cellule ya EpCAM-, yina kele mingi kuluta kisalu ya kubongisa bima ya nitu ya ba fibroblaste na ba cellule ya tumeur na TME (Kifwanisu 1, E mpe F).
(A na B) Kuluta ngolo ya mvingu ya bantu (MFI) ya kubaka sukadi (2-NBDG) (A) mpe kisalu ya mitochondrie ya baselile ya CD4 + T (MitoTracker ya mbwaki ya ngolo) (B) Ba graphique ya kifwani (na diboko ya kibakala) mpe ba nsangu ya bo me tula na tablo (na diboko ya kibakala), baselile ya CD8 + T mpe baselile ya EpCAM + ya CD45-. (C) Ntalu ya baselile ya CD4 + ti ya CD8 + (ya baselile ya CD3 + T) na kati ya maladi ya ntu mpi ya ntu. (D) Kitini ya baselile ya EpCAM + na kati ya maladi ya ntu mpi ya maladi ya ntu (CD45−). (E na F) Kubaka sukadi na nitu (2-NBDG) (E) mpi kisalu ya mitokondrie (MitoTracker mbwaki ya ngolo) (F) bagrafe ya ke monisa (na diboko ya kimama) mpi bansangu ya bo me tula na tablo ( Na diboko ya kitata) Baselile ya ntu mpi baselile ya nitu. (G) Ba graphique ya ke monisa mutindu CD25, CD137 mpe PD1 ke basikaka na nzila ya cytométrie de flux. (H na I) Kumonana ya CD25, CD137 na PD1 na baselile ya CD4 + T (H) na baselile ya CD8 + T (I). (J na K) Ba nzila ya kuzaba mambu, ya kuzaba mambu (Tcm), ya kuzaba mambu (Teff) mpe ya kuzaba mambu (Tem) yina me simbama na mutindu ya kumonisa CCR7 mpe CD45RO. Bifwanisu ya ke monisa (na diboko ya kimama) mpi bansangu ya bo me tula na ndonga (na diboko ya kitata) ya baselile ya CD4 + T (J) mpi ya baselile ya CD8 + T (K) na maladi ya ntu mpi ya maladi ya ntu. Ba ntalu ya P me zabana na nzila ya t-test ya zole (*P<0,05, **P<0,01 mpe ***P<0,001). Mulongo ke monisa ba mbefo yina me fwanana (n = 6). FMO, nsemo ya kukatula mosi; MFI, ngolo ya mvingu ya bantu.
Kufimpa yankaka kumonisaka luswaswanu yankaka ya mfunu na kati ya kikalulu ya phenotype ya baselile T yina bo meyidika mbotembote. Kuyibuka yina me salama (Kifwanisu 1, G tii na I) mpi yina ke salaka (Kifwanisu 1, J mpi K) na ba tumeur ke vandaka mingi kuluta ba ascite (kiteso ya baselile CD3 + T). Mutindu mosi, kutadila mutindu ya nitu na nzila ya kutuba ya bidimbu ya kupesa ngolo (CD25 mpi CD137) mpi bidimbu ya kukonda ngolo [proteine ​​ya lufwa ya baselile yina bo me yidikaka 1 (PD1)] monisaka nde ata bikalulu ya mvingu ya bantu ya bantu yai kele ya kuswaswana (Kifwanisu S1, B tii na E) , Kansi ata luswaswanu mosi ve ya mfunu ya mvingu ya bantu vandaka kumonana na mutindu mosi (Kifwanisu S1, B tii na E) . F na mono). Ba mvutu yayi me ndimama na kusadilaka ba nzila ya kulonguka ya masini samu na kupesa na mutindu mosi ba nsangu ya ba cellule (21), yina me monisa diaka ti ntalu ya mingi ya ba cellule ya mikwa (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) kele na kati ya ascite ya mbefo (Kifwanisu S2A ). Na kati ya mitindu yonso ya baselile yina bo me zaba, kimvuka yai ya baselile ya myéloïde monisaka nde yo ke bakaka sukadi mingi mpi yo ke salaka mingi (Kifwanisu S2, B tii na G). Ba mvutu yayi ke monisa luswaswanu ya ngolo ya metabolique na kati ya mitindu mingi ya ba cellule yina ke monanaka na ascite mpe na ba tumeurs na ba mbefo ya HGSC.
Mpasi ya nene na kubakisa bikalulu ya metabolique ya TIL kele mfunu ya kukatula ba échantillons ya ba cellules T ya bunkete, ya mbote mpe ya kufwanana na ba tumeurs. Ba nsosa ya ntama ve me monisa ti ba nzila ya kupona mpe ya kutunga ba mbuma yina me simbama na cytométrie ya flux lenda nata bansobolo na ba nzila ya bima ya ke sadisaka na nitu ( 22-24 ). Samu na kununga mpasi yayi, beto me bongisa mutindu ya kutunga ba mbuma samu na ku katula mpe ku katula TIL na kansere ya ba mbuma ya muntu yina ba me katula na nzila ya operation na ntwala ya ku fiongunina na nzila ya LC-MS/MS (tala Bima mpe ba nzila; Kifwanisu 2A). Na kutala bupusi ya mvimba ya protocole yayi na ba nsobolo ya bima ya ke tambulaka na nitu, beto fwanisaka ba nsangu ya bima ya ke tambulaka na nitu ya ba cellule T yina ba donateurs ya mavimpi ya mbote ke salaka na nima ya kitambi ya kukabula ba mbuma yina beto me tubila na zulu ti baselile yina vandaka ve ya kukabwana na ba mbuma kansi yina bikalaka na zulu ya glace. Kufiongunina yayi ya kutala mbote mbote me monisa ti kele na nguizani ya nene na kati ya ba mambu zole yayi (r = 0,77), mpe mvingu ya bantu ya tekiniki ya kimvuka ya ba mvingu ya bantu 86 kele na mvingu ya bantu mingi (Kifwanisu 2B). Na yina, bametode yayi lenda sala analyse ya sikisiki ya bima yina ke balukaka na baselile yina ke na kutambula na mutindu ya baselile, na mutindu yina yau lenda pesa nzila ya ntete ya ngolo ya kuzaba bima ya sikisiki yina kele na HGSC, na mutindu yina yau lenda sadisa bantu na kubakisa mbote-mbote mambu ya sikisiki ya baselile Programe ya bima yina ke balukaka na nitu ya kuvukisa nitu.
(A) Kifwanisu ya ke monisa mutindu ya kutunga bima ya magnétique. Na ntwala ya kusala bansosa na nzila ya LC-MS/MS, baselile yango tasala banzietelo tatu ya kulandana ya bo tasala ti bima ya ngolo to yo tabikala na zulu ya glace. (B) Bupusi ya mutindu ya kutunga na bumbidi ya bima yina ke sadisaka na nitu. Mwayene ya ba mesure tatu samu na konso mutindu ya kutunga ± SE. Nsinga ya gris ke monisa kuwakana ya 1:1. Kuwakana ya kati ya ba ndonga (CIC) ya ba mesure ya kuvutukila ke monisama na étiquette ya axis. NAD, nkisi ya ke sadisaka na kubasisa menga. (C) Kifwanisu ya kisalu ya kufimpa bima ya nitu ya mbefo. Bau ke bakaka ascite to tumeur na bambefo mpe bau ke bumbaka yau na madidi. Bau fimpaka kitini ya fioti ya konso mbandu na nzila ya cytométrie de flux, na ntangu yina ba mbandu yina bikalaka salaka ba nzietolo tatu ya kutunga ba cellule CD4+, CD8+ mpe CD45-. Bo tadilaka bitini yai ya baselile na nsadisa ya LC-MS/MS. (D) Karti ya tiya ya kufwanana ya bima ya ke sadisaka na nitu. Dendrogramme ke monisa kimvuka ya Ward ya ba ntama ya Euclide na kati ya ba mbandu. (E) Kufiongunina bima ya mfunu (PCA) ya karte ya bima ya ke sadisaka na nitu ya mbandu, ke monisa ba mvutukulu tatu ya konso mbandu, ba mbandu ya mbefo mosi ke vukana na nzila ya nzila. (F) PCA ya nsangu ya metabolite ya mbandu yina bo me tula na zulu ya mbefo (disongidila, kusadila redondance ya ndambu); mutindu ya mbandu kele na ndilu na coque ya convexe. PC1, kitini ya nene 1; PC2, kitini ya nene 2.
Na nima, beto sadilaka mutindu yayi ya kutunga samu na kufiongunina bima 99 yina ke balukaka na kati ya bima ya CD4 +, CD8 + mpe CD45 na kati ya ba ntuidi ya ntete mpe ba ntuidi ya ba mbefo sambanu ya HGSC (Kifwanisu 2C, Kifwanisu S3A mpe Tableau S3 mpe S4). Bantu ya mfunu kele 2% tii na 70% ya mbandu ya nene ya baselile ya luzingu ya kisina, mpi ntalu ya baselile ke swaswana mingi na kati ya bambefo. Na nima ya kukabula ba mbuma, kitini ya mfunu ya kufuluka (CD4+, CD8+ to CD45-) ke bakaka kuluta 85% ya baselile yonso ya ke zingaka na kati ya mbandu na mwayene. Metode yai ya kutomisa ke pesaka beto nzila ya kutadila ntalu ya baselile yina ke katukaka na mutindu nitu ya muntu ke balulaka bima yina kele na nitu, diambu yina beto lenda sala ve na ba échantillon ya nene. Na kusadilaka mutindu yayi, beto me zaba ti l-kynurénine mpe adénosine, bima zole yayi ya ke sadisaka nitu na kukangama mbote, me tombuka na ba cellule T ya tumeur to na ba cellule ya tumeur (Kifwanisu S3, B mpe C). Na yau, bamvutu yai kemonisa kwikama mpi makuki ya kukabula baselile na beto mpi ya teknolozi ya spectrométrie ya masse sambu na kuzwa bima yina kevandaka mfunu na biolozi na kati ya mikanda ya mbefo.
Kufiongunina na beto monisaka mpi kukabwana ya ngolo ya mitindu ya baselile na kati mpi na kati ya bambefo (Kifwanisu 2D mpi Kifwanisu S4A). Mingimingi, kana beto fwanisa yau na ba mbefo yankaka, mbefo 70 monisaka bifu ya kuswaswana ya mvingu ya bantu (Kifwanisu 2E mpe Kifwanisu S4B), yau ke monisa ti lenda vanda na hétérogénéité ya mvingu ya bantu ya nene na kati ya ba mbefo. Yau kele mfunu na kuzaba ti kana beto fwanisa yau na ba mbefo yankaka (ba litre 1,2 tii na 2; Tableau S1), ntalu ya mvimba ya ba ascites yina ba vukisaka na mbefo 70 (80 ml) vandaka fioti. Kutala mutindu ya kukonda kuwakana na kati ya bambefo na ntangu ya kufiongunina bima ya mfunu (mu mbandu, kusadila kufiongunina ya ndambu ya redondance) ke monisa bansoba ya ke landanaka na kati ya mitindu ya baselile, mpi mitindu ya baselile mpi/to kisika ya fioti ke vukanaka pwelele na kutadila mutindu ya bima yina ke balukaka na nitu (Kifwanisu 2F ). Kutadila bima yina ke balukaka na nitu mosi-mosi tulaka dikebi na mambu yai mpi monisaka luswaswanu ya nene na kati ya mitindu ya baselile mpi kisika yina bo ke zingaka. Yau kele mfunu na kuzaba nde luswaswanu ya kuluta ngolo ya bo me mona kele ARN, yina ke vandaka mbala mingi ti baselile CD45- mpi baselile CD4+ mpi CD8+ yina ke kotaka na kati ya ntulu (Kifwanisu 3A). Sambu na baselile ya CD4 +, bupusi yai ke monanaka mingi, mpi yo ke monana nde ADN yina kele na baselile ya CD8 + ke vandaka mpi ti bupusi ya ngolo na kisika yina yo ke zingaka. Kansi, yau kele mfunu ve, samu kaka ba mbefo tatu na kati ya ba mbefo sambanu lenda fiongunina ba nsangu ya CD8+ ya tumeur. Na zulu ya ADN, na mitindu ya kuswaswana ya baselile na kati ya ba ascite na ba tumeurs, ba metabolites yankaka yina kele na bikalulu ya mbote ve na TIL kele mpe na kimvwama ya kuswaswana (Bifwanisu S3 na S4). Na yau, bansangu yai kemonisa kimvuka mosi ya mbote ya bima yina kesadisaka nitu na kununga maladi sambu na kusala bansosa yankaka.
(A) Kuyidika mbote-mbote mambu ya kele na kati ya baselile ya CD4+, CD8+ mpi CD45- yina ke katukaka na maladi ya ntu mpi na tumeur. Kifwanisu ya kesi ya ke monisa kati-kati (nzila), kisika ya kati-kati (charnière ya kadre) mpi kisika ya bansangu, tii na mbala 1,5 ya kisika ya kati-kati (mandefu ya kadre). Mutindu ba me tubila yau na Bima ya mbefo mpe ba nzila, sadila ntalu ya limma ya mbefo samu na kuzaba ntalu ya P (*P<0,05 mpe **P<0,01). (B) Kifwanisu ya ke monisa mutindu ADN ke balukaka (60). Bima yina ke balukaka na nitu: S-adénosil-1-méthionine; SAH, S-adénosine-1-homocystéine; NA, nikotina; MNA, 1-metilnikotinamide; 2-PY, 1-metil- 2-piridone-5-karboksamide; 4-PY, 1-metil-4-piridone-5-karboksamide; NR, ntunga ya nikotina; NMN, nkisi mosi ya bo ke bingaka nicotine. Ba enzyme (ya vert): NNMT, yina ke sadisaka na kubasisa menga; SIRT, ba mfumu; NAMPT, nkisi yina ke sadisaka na kubasisa menga; AOX1, nkisi ya ke sadisaka na kubasisa masa 1; NRK, nsinga ya ke sadisaka na kubasisa menga; NMNAT, nkisi mosi ya ke sadisaka na kubasisa menga; Pnp1, nkisi ya ke sadisaka na kubasisa masa. (C) t-SNE ya ARN-seq ya mpusu ya nitu (ya gris) mpi ya tumeur (ya mbwaki; n = bambefo 3). (D) Kumonisa ya NNMT na bimvuka ya baselile ya kuswaswana yina bo me zaba na kusadilaka ARN-seq. (E) Kumonisa ya NNMT mpi ya AOX1 na SK-OV-3, na 293T ya rein ya mwana ya muntu (HEK), na baselile ya T mpi na baselile ya T yina bo me sansa ti ADN. Bau ke monisa bangogo ya kukangama na yina me tala SK-OV-3. Mutindu ya kutuba na SEM me monisama (n = 6 ba donateurs ya mavimpi ya mbote). Ba ntalu ya Ct kuluta 35 ke tadisamaka bonso ya kukonda kuzaba (UD). (F) Kumonisa ya SLC22A1 mpi ya SLC22A2 na kati ya baselile T mpi baselile T yina bo me sansa ti ADN ya 8mM. Bau ke monisa bangogo ya kukangama na yina me tala SK-OV-3. Mutindu ya kutuba na SEM me monisama (n = 6 ba donateurs ya mavimpi ya mbote). Ba ntalu ya Ct kuluta 35 ke tadisamaka bonso ya kukonda kuzaba (UD). (G) Kuvanda na ADN ya baselile na baselile ya T ya mavimpi ya mbote yina bo me salaka na nima ya bangunga 72 ya kukangama ti ADN. Mutindu ya kutuba na SEM me monisama (n = 4 ba donateurs ya mavimpi ya mbote).
MNA ke basikaka na kukatulaka kimvuka ya methyle yina ke katukaka na SAM (SAM) mpi ke tulaka yo na nicotinamide (NA) na nzila ya methylide N (NNMT; Kifwanisu 3B). NNMT ke monisamaka mingi na ba kansere ya mutindu na mutindu ya bantu mpe yau ke vukanaka na kukula, kukota na kati mpe kupanzana ya ba kansere (25-27). Samu na kuzaba mbote kisina ya MNA na ba cellule T na TME, beto sadilaka scRNA-seq samu na ku monisa mutindu ya ku monisa NNMT na kati ya mitindu ya ba cellule na kati ya ba ntulu mpe ba ntulu ya ba mbefo tatu ya HGSC (Tableau S5). Kufiongunina baselile kiteso ya 6 500 monisaka nde na bisika yina kele ti ba ascite mpi ba tumeur, NNMT vandaka kumonana kaka na baselile yina bo vandaka kuyindula nde yo kele ti ba fibroblaste mpi ba tumeur (Kifwanisu 3, C mpi D). Yau kele mfunu na kuzaba ti, ata NNMT mosi ve ke monisa pwelele na konso kimvuka ya bantu yina ke monisa PTPRC (CD45 +) (Kifwanisu 3D mpe Kifwanisu S5A), yina ke monisa ti ADN yina me monana na nzila ya mvingu ya bantu me kota na kati ya baselile ya T. Kumonisa ya aldehyde oxidase 1 (AOX1) ke balulaka ARN na 2-PYR to 4-PYR; Kifwanisu 3B) kele mpi kaka sambu na kimvuka ya ba fibroblaste yina ke basisaka COL1A1 (Kifwanisu S5A), yina na kimvuka ke monisa nde baselile T ke vandaka ve ti makuki ya kuyidika mambu ya ADN yina bantu ke sadilaka. Mutindu ya kumonisa ba gènes yayi ya ke tadila MNA me zikisama na kusadilaka kimvuka ya zole ya ba nsangu ya baselile ya kimpwanza yina me katuka na ba mbefo ya HGSC (Kifwanisu S5B; n = 6) (16). Na zulu ya mambu yina, analyse ya qPCR ya ba cellules T ya ba donateurs ya mavimpi ya mbote yina ba me sansa na MNA monisaka ti kana beto fwanisa yau na ba cellules ya tumeur ya ba ovaire ya SK-OV-3 ya kutala, NNMT to AOX1 vuandaka pene-pene ya kumonana ve (Kifwanisu 3E). Bamvutu yai ya bantu vandaka kuvingila ve kemonisa nde ADN lenda basika na baselile ya nitu to na ba tumeur mpi kukota na baselile ya T yina kele penepene na TME.
Ata bantu yina ke zola kukuma bamfumu kele dibuta ya bantu yina ke nataka bima ya ke zingaka 1 tii na 3 (OCT1, OCT2 mpi OCT3) yina bo me sonikaka na code na dibuta ya bima yina ke nataka bima yina ke lembaka (SLC22) (SLC22A1, SLC22A3), bantu yina lenda nata MNA kele kaka ya kukonda kutendula (28). QPCR ya ARNm ya baselile T ya ba donateur ya mavimpi ya mbote monisaka kitezo ya fioti ya SLC22A1 kansi kitezo ya SLC22A2 yina lenda monana ve, yina ndimisaka nde bo tubilaka yo ntete na mikanda (Kifwanisu 3F) (29). Na kuswaswana, nzila ya baselile ya SK-OV-3 ya ke basisaka maladi ya divumu vandaka kumonisa kiteso ya mingi ya bima yonso zole yina ke nataka bima (Kifwanisu 3F).
Sambu na kumeka kana baselile T kele ti makuki ya kubaka ARN ya banzenza, bo kunaka baselile T ya mavimpi ya mbote yina vandaka kupesa menga na nsungi ya bangunga 72 na ntwala ya ba ADN ya kuswaswana. Na kukonda ya ADN ya exogène, mambu ya kele na kati ya baselile ya ADN lenda zabana ve (Kifwanisu 3G). Kasi, ba cellules T activées yina ba me sansa na ba cellules exogènes monisaka kukula ya ba cellules ya ba cellules na kutadila dose, tii na 6 mM ya ba cellules (Kifwanisu 3G). Mvutu yai kemonisa nde ata nivo ya fyoti ya kumonisama ya bantu yina kenataka bima mpi kukonda enzyme ya nene yina kele na mukumba ya kubalula AMM na kati ya baselile, TIL lenda baka kaka AMM.
Kuvanda ti bima mingi yina ke sobaka nitu na baselile ya T ya bambefo mpi kumeka yina bo ke salaka sambu na kubaka ADN na nitu ke kumisaka ngolo dibaku yina baselile yina ke vandaka ti kansere (CAF) ke basisaka ADN mpi baselile ya tumeur lenda yidika mutindu TIL ke monanaka mpi kisalu na yo. Sambu na kuzaba bupusi ya ADN na baselile T, bo salaka nde baselile T yina kele ti mavimpi ya mbote kusala na in vitro kana ADN kele to ve, mpi bo tadilaka mutindu yo ke kumaka mingi mpi mutindu yo ke basisaka ba cytokine. Na nima ya bilumbu 7 ya kuyika MNA na dose ya kuluta mingi, ntalu ya bantu yina ke kumaka mbala zole kulumukaka na kitezo mosi, na ntangu yina ngolo vandaka kaka na badose nyonso (Kifwanisu 4A). Diaka, kusansa ADN ya ke katukaka na nganda ya nitu salaka nde ntalu ya baselile T CD4 + mpi CD8 + yina ke monisaka facteur de nécrose tumeur-α (TNFα; Kifwanisu 4B) kuma mingi. Na kuswaswana, kusalama ya IFN-γ na kati ya baselile vandaka kukita mingi na baselile ya CD4 + T, kansi ve na baselile ya CD8 + T, mpi nsoba ya nene vandaka ve na kati ya baselile ya 2 (IL-2; Kifwanisu 4, C mpi D). Na yina, test ya kukangama na ba enzyme (ELISA) ya bima yina ke bikalaka na zulu ya ba mbuma yai ya ba cellule T yina bo me sadila MNA monisaka nde TNFα me kuma mingi, IFN-γ me kulumuka, mpi IL-2 me soba ve (Kifwanisu 4, E tii na G). . Kukulumuka ya IFN-γ ke monisa nde ADN lenda sala kisalu ya kukanga kisalu ya baselile T yina ke nwanaka ti tumeur. Na nsadisa ya kulanda bupusi ya ADN na zulu ya baselile ya T, baselile ya ke bakaka menga ya bantu yina ke pesaka menga ( FRα-CAR-T ) yina ke bakaka menga ya bantu yina ke pesaka menga ( FRα-CAR-T ) ke basikaka na baselile ya menga ya bantu yina ke pesaka menga yina kele ti mavimpi ya mbote. Bau vandaka kuyedisa baselile ya CAR-T na nsungi ya bangunga 24 na ntwala ya ADN, mpi na nima bau vandaka kuyedisa yau kumosi ti baselile ya SK-OV-3 ya muntu yina vandaka kumonisa α ya ke bakaka folate na kiteso ya 10:1. Kusansa ya MNA salaka nde kisalu ya kufwa baselile ya FRα-CAR-T kukulumuka mingi, yina vandaka kiteso mosi ti baselile ya FRα-CAR-T yina bo sansaka ti adenosine (Kifwanisu 4H).
(A) Ntalu ya baselile yonso ya ke zingaka mpi ntalu ya bantu yina ke zingaka mbala zole (PD) mbala mosi katuka na culture na kilumbu ya 7. Graphique ya barre ke monisa mwayene + SEM ya bantu sambanu yina ke pesaka menga yina kele ti mavimpi ya mbote. Kumonisa bansangu ya me katuka na ata n = 3 ya ba eksperiansi ya kimpwanza. (B tii na D) Bo sadilaka CD3/CD28 mpi IL-2 sambu na kusala nde baselile T kusala na kiteso ya ADN na bo na nsungi ya bilumbu 7. Na ntwala ya kusala bansosa, bo vandaka kupesa baselile ngolo ti PMA/ionomycine ti GolgiStop na nsungi ya bangunga 4. TNFα (B) ke basikaka na baselile ya T. Mbandu ya kifwanisu (na diboko ya kimama) mpi bansangu ya bo me tula na ndonga (na diboko ya kitata) ya mutindu TNFα ke basikaka na baselile ya ke zingaka. IFN-γ (C) mpi IL-2 (D) ke basikaka na baselile T. Bo vandaka kutesa mutindu ba cytokine vandaka kubasika na nzila ya cytométrie de débit. Graphique ya barre ke monisa mwayene (n = 6 ya ba pesa menga ya mavimpi ya mbote) + SEM. Sadila nzila mosi ya kufiongunina ya kuswaswana na ba nsangu ya kuvutukila (*P<0,05 na **P<0,01) samu na kuzaba ntalu ya P. Kumonisa bansangu ya me katuka na ata n = 3 ya ba eksperiansi ya kimpwanza. (E tii na G) Bo sadilaka CD3/CD28 mpi IL-2 sambu na kusala nde baselile T kusala na kiteso ya ADN na bo na nsungi ya bilumbu 7. Bau vukisaka bima ya kati na ntwala mpe na manima ya bangunga 4 ya kupesa PMA/ionomycine. Bau me tesaka ntalu ya TNFα (E), IFN-γ (F) mpi IL-2 (G) na nzila ya ELISA. Graphique ya barre ke monisa mwayene (n = 5 ya ba pesa menga ya mavimpi ya mbote) + SEM. Ntalu ya P me zabana na kusadilaka nzila mosi ya kufiongunina ya luswaswanu mpe ya kutesa mbala na mbala (*P<0,05). Ligne ya matonsi ke monisa ndilu ya kuzaba ya kuzaba. (H) Kusala lyse ya baselile. Bau ke yidikaka baselile ya FRα-CAR-T to ya GFP-CAR-T ti adenosine (250 μM) to ARN (10 mM) na nsungi ya bangunga 24, to kubika yau kukonda kusadila nkisi (Ctrl). Bo tesaka ntalu ya baselile ya SK-OV-3 yina bo fwaka. Ntalu ya P me zabana na nzila ya t ya Welch (*P<0,5 mpe **P<0,01).
Na kuzwa nzayilu ya mekanika ya nsikudukusu ya kumonisa TNFα yina ke tadila AMM, ba me tala bansobolo na ARNm ya TNFα ya ba cellules T yina me sansama na AMM (Kifwanisu 5A). Ba cellule T ya mavimpi ya mbote yina bo sansaka ti ADN monisaka nde ntalu ya TNFα yina bo ke sonikaka me kuma mingi mbala zole, yo ke monisa nde ADN ke tadilaka mutindu TNFα ke sonikaka mambu. Sambu na kusosa kuzaba mutindu yai ya kuyidika mambu, bo tadilaka mambu zole ya me zabanaka yina ke twadisaka TNFα, disongidila, facteur nucléaire ya baselile T yina ke salaka (NFAT) mpi proteine ​​1 ya siki-siki (Sp1), sambu na kupesa mvutu na mutindu ADN ke kangamaka na muntu yina ke twadisaka TNFα yina kele pene-pene ( 30 ). Muntu yina ke pesaka maboko na TNFα kele ti bisika 6 yina bo me zaba nde NFAT ke vukanaka mpi bisika 2 yina Sp1 ke vukanaka, yina ke vukanaka na kisika mosi [-55 paire de base (bp) katuka na 5’cap] (30). Kukangama ya chromatine (ChIP) monisaka nde kana bo sadila yo ti ADN, kukangama ya Sp1 ti muntu yina ke sadisaka TNFα ke kumaka mingi mbala tatu. Kukotisa NFAT mpe me kuma mingi mpe me kuma pene-pene na mfunu (Kifwanisu 5B). Bansangu yai ke monisa nde MNA ke twadisaka mutindu TNFα ke basikaka na nzila ya Sp1, mpi na kiteso ya fioti mutindu NFAT ke basikaka.
(A) Kana beto fwanisa yo ti baselile T yina bo me yedisaka kukonda ADN, nsoba ya mbala mingi ya mutindu TNFα ke basikaka na baselile T yina bo me sansaka ti ADN. Mutindu ya kutuba na SEM me monisama (n = 5 ba donateurs ya mavimpi ya mbote). Kumonisa bansangu ya me katuka na ata n = 3 ya ba eksperiansi ya kimpwanza. (B) Muntu yina ke sadisaka TNFα na baselile ya T yina bo me sansa ti to kukonda ADN ya 8 mM na nima ya kuvukisa NFAT mpi Sp1 ti (Ctrl) mpi kupesa ngolo na PMA/ionomycine na nsungi ya bangunga 4. Bau sadilaka immunoglobuline G (IgG) mpe H3 mutindu bima ya yimbi mpe ya mbote samu na kuzaba kana mvingu ya bantu kele na kimbevo ya ntu. Kutanga ntalu ya ChIP monisaka nde kukangama ya Sp1 ti NFAT na muntu yina ke sadisaka TNFα na baselile yina bo me sansa ti MNA kumaka mingi mbala mingi kana beto fwanisa yo ti baselile yina bo me sansa. Kumonisa bansangu ya me katuka na ata n = 3 ya ba eksperiansi ya kimpwanza. Ntalu ya P ke zabanaka na ba test t mingi (*** P <0,01). (C) Kana beto fwanisa yo ti ascite ya HGSC, baselile T (yina ke fwaka ve baselile ya nitu) monisaka nde TNF vandaka kumonana mingi na kati ya tumeur. Ba couleur ke monisa ba mbefo ya kuswaswana. Ba cellules yina me monisama me bakama na mutindu ya kukonda kukana tii na 300 mpe me nikisa yau samu na kufiongunina kulutisa (** Padj = 0,0076). (D) Mutindu ya bo me pesa ya MNA sambu na kansere ya divumu. ADN ke basikaka na baselile ya tumeur mpi na baselile yina kele na TME mpi baselile T ke bakaka yo. MNA ke kumisaka ngolo kukangama ya Sp1 ti muntu yina ke sadisaka TNFα, ebuna yo ke salaka nde TNFα kukuma mingi mpi yo ke salaka nde TNFα kubasika mingi. MNA ke salaka mpi nde IFN-γ kukulumuka. Kukanga kisalu ya baselile T kenataka na kukulumusa makuki ya kufwa bantu mpi na kuyela nswalu ya tumeur.
Na kutadila bansangu, TNFα kele ti bupusi ya ntu mpi ya nima yina ke sadisaka na kunwanisa mpi na nima, kansi yo kele ti mukumba ya me zabanaka mbote ya kusadisa kuyela mpi kupanzana ya kansere ya divumu ( 31-33 ). Na kutadila bansangu, ntalu ya TNFα yina kele na nitu ya bantu yina ke belaka kansere ya divumu kele mingi kuluta yina kele na nitu ya mbote (34-36). Na yina metala mutindu ya kusala mambu, TNFα lenda yidika kisalu, kisalu mpi kuyela ya baselile ya mpembe ya menga, mpi kusoba mutindu ya baselile ya kansere ( 37, 38 ). Na kuwakana ti mambu yai ya bo me mona, kufimpa mutindu ba gène ke basikaka na mutindu ya kuswaswana monisaka nde TNF vandaka ti kiyeka ya nene na baselile ya T na kati ya mikanda ya tumeur kana beto fwanisa yo ti ascite (Kifwanisu 5C). Kuyela ya nsangu ya TNF vandaka kumonana kaka na ba ntalu ya ba cellule T yina kele na kifwani ya kukonda kufwa ba cellule (Kifwanisu S5A). Na bunkufi, bansangu yai ke ndimisa dibanza ya ke tuba nde MNA kele ti mambu zole ya ke kangaka ngolo ya nitu mpi ya ke sadisaka nitu na kukuma ti tumeur na HGSC.
Kutula bidimbu ya fluorescent yina me simbama na cytométrie de débit me kuma metode ya ntete ya kulonguka mutindu TIL ke balulaka bima. Ba nsosa yayi me monisa ti kana beto fwanisa yau na ba lymphocytes ya menga ya nziunga to ba cellules T ya ke katukaka na binama ya lymphoïde ya zole, TIL ya ba nsusu mpe ya bantu ke vandaka na kifu ya kubaka sukadi (4, 39) mpe kuvidisa malembe-malembe kisalu ya ba mitokondrie (19, 40). Ata beto me mona mambu ya mutindu mosi na kulonguka yai, kima ya mfunu ya bo me sala kele kufwanisa mutindu baselile ya tumeur ke balulaka nitu mpi TIL yina ke katukaka na mukanda ya tumeur yina bo me katulaka. Na kuwakana ti mwa bansangu yai ya ntama, baselile ya tumeur (CD45-EpCAM +) yina kekatukaka na ascite mpi na baselile ya tumeur kevandaka ti sukadi mingi kuluta baselile T ya CD8 + mpi CD4 +, yo kendimisa nde baselile ya tumeur kebakaka sukadi mingi ti baselile ya T. Dibanza ya kutesana ya baselile T. TME. Kansi, kisalu ya baselile ya tumor kele mingi kuluta ya baselile ya CD8 + T, kansi kisalu ya baselile ya CD4 + T kele kiteso mosi ti ya baselile ya CD4 + T. Ba mvutu yayi ke pesa ngolo na ntu-dyambu yina ke basika nde mvingu ya bantu kele mfunu sambu na baselile ya tumeur ( 41, 42 ). Bau ke tuba diaka ti baselile ya CD8 + T lenda vanda na mpasi mingi na kusala mbote ve kuluta baselile ya CD4 + T, to baselile ya CD4 + T lenda sadila bisika ya nkaka ya carbone katula kaka sukadi samu na kutanina kisalu ya mitokondrie (43, 44). Beto fwete zaba nde beto monaka ve luswaswanu na yina me tala kubaka sukadi to kisalu ya mitokondrie na kati ya baselile ya CD4 + T, baselile ya T yina ke salaka kisalu mpi baselile ya T yina ke salaka kisalu ya ntu na kati ya maladi ya ntu. Mutindu mosi, kikalulu ya kuswaswanisa baselile CD8 + T na kati ya ba tumeur kele ve na kuwakana ti bansoba ya kubaka sukadi, yina ke monisa luswaswanu ya nene na kati ya baselile T yina bo me yedisaka na kati ya nsuni mpi TIL ya muntu na nsuni ( 22 ). Ba nsangu yayi me ndimama mpe na kusadila mutindu ya kukabula ntalu ya baselile na mutindu mosi ya kukonda kupona-pona, yina monisaka diaka ti baselile ya CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + yina ke bakaka sukadi mingi mpe kisalu ya mitokondrie kuluta baselile ya tumeur kele mingi kansi kele na ntalu ya baselile yina ke salaka kisalu ya metabolique. Kimvuka yai lenda monisa kimvuka ya fioti ya bantu yina bo ke yindulaka nde yo kele baselile yina ke kangaka myéloïde to baselile yina ke kangaka misisa ya menga yina bo me zaba na nsadisa ya analize ya scRNA-seq. Ata bo me zabisaka mambu yai yonso zole na ba tumeurs ya ba ovaire ya bantu [45], yo kele kaka na mfunu ya Kisalu ya nkaka kele ya kutendula kimvuka yai ya fioti ya myéloïde.
Ata bametode yina kesimbamaka na cytométrie de flux lenda tendula luswaswanu ya nene yina kele na kati ya bamikrobe mpi bamikrobe na kati ya mitindu ya baselile, bo mezaba ntete ve bima ya sikisiki yina sukadi to bisika yankaka ya carbone kebasikaka sambu na bamikrobe na TME. Kupesa kuvanda to kukonda kuvanda ya bima yina ke balulaka nitu na kimvuka mosi ya fioti ya TIL ke lombaka kusukula kimvuka ya baselile yina kele na mukanda ya bo me katula. Na yau, metode na beto ya kutomisa baselile kumosi ti spectrométrie ya masse lenda pesa mayele na yina metala bima yina kevandaka na kati ya baselile yina kekumaka kitoko na mutindu ya kuswaswana na baselile T mpi na kimvuka ya baselile ya tumeur na ba échantillons ya bambefo yina kewakana ti yo. Ata metode yai kele ti mambote kuluta mutindu ya kupona baselile na nsadisa ya fluorescence, babiblioteke ya nkaka ya bima yina ke vandaka na nitu lenda beba sambu na ngolo yina yo ke vandaka ti yo mpi/to sambu yo ke balukaka nswalu ( 22 ). Ata mpidina, metode na beto kukaka kuzaba bima zole yina kekangaka ngolo ya nitu yina bo mezaba, disongidila, adenosine mpi kynurénine, sambu yo keswaswanaka mingi na kati ya mitindu ya bambandu.
Kufimpa na beto ya bima ya ke sadisaka nitu na kuzaba mambu mingi ya me tala kisalu ya bima yina ke sadisaka na nitu na TME ya ba ovaire. Ya ntete, na kusadilaka cytométrie de flux, beto monaka nde luswaswanu vandaka ve na kati ya bisalu ya mitokondrie na kati ya baselile ya CD4 + T. Kasi, lusalusu ya LC-MS/MS monisaka bansobolo ya nene na yina me tala ntalu ya bima yina ke tambulaka na kati ya ba ntuidi yayi, yau ke monisa ti mambu yina ba me baka na yina me tala mvingu ya bima ya TIL mpe kisalu na yau nyonso ya mvingu ya bantu ke lomba kutendula mbote-mbote. Ya zole, ADN kele kima yina ke balulaka nitu yina kele ti luswaswanu ya nene na kati ya baselile CD45 mpi baselile T yina kele na ascite, kansi ve na tumeur. Na yina, kukabula na bitini mpe kisika ya tumeur lenda vuanda na bupusi ya mutindu na mutindu na mutindu ya kusadila bima ya TIL, yina ke monisa mutindu ya kuswaswana yina lenda salama na kisika mosi ya fioti. Ya tatu, mutindu enzyme yina ke basisaka ADN NNMT ke basikaka mingi-mingi na CAF, yina kele baselile ya tumeur na kiteso ya fioti, kansi bo ke monaka kiteso ya ADN yina bo lenda mona na baselile ya T yina ke katukaka na tumeur. Kumonisa mingi ya NNMT na CAF ya ba ovaire kele na bupusi ya kuzabana ya ke sadisaka na kubasisa kansere, ndambu na yo ke katukaka na kusadisa CAF na kubaluka, na kukota ya tumeur mpi na kupanzana ya tumeur (27). Ata nivo ya mvimba ya TIL kele na kati-kati, kumonisa ya NNMT na CAF kele na kuwakana ya ngolo ti mutindu ya fioti ya mvingu ya bantu (TCGA), yina ke wakana ti mvingu ya bantu ya mbi (27, 46, 47). Na nsuka, kubasika ya enzyme AOX1 yina kele na mukumba ya kubebisa ARN ke suka mpi kaka na kimvuka ya bantu ya CAF, yina ke monisa nde baselile T ke vandaka ve ti makuki ya kubalula ARN. Bamvutu yai kendimisa dibanza nde ata yo kelomba kusala kisalu yankaka sambu na kuzikisa mambu yai ya bo memona, kana ADN kele mingi na baselile ya T, yo lenda monisa nde kele ti kisika mosi ya fyoti yina kekangaka ngolo ya nitu ya CAF.
Na kutadila kiteso ya fioti ya bima yina ke nataka ADN mpi kiteso ya baproteine ​​ya mfunu yina ke kotaka na kisalu ya kuyidika ADN yina bo lenda mona ve, kuvanda ya ADN na baselile ya T kele kima yina beto lenda vingila ve. NNMT to AOX1 lendaka kuzabana ve na nzila ya kufiongunina scRNA-seq mpi qPCR ya bo metulaka lukanu ya bimvuka zole ya bantu yina kele na kimpwanza. Bamvutu yai kemonisa nde ADN kesalamaka ve na baselile ya T, kansi yo kebakaka yo na TME yina kele na nziunga. Bametode yina bo me salaka na vitro ke monisa nde baselile T ke vandaka ti kikalulu ya kuvukisa ADN yina ke katukaka na nganda.
Bakulonguka na beto ya in vitro memonisa nde ADN ya nganda kepusaka TNFα na kubasika na baselile ya T mpi kekumisaka ngolo kukangama ya Sp1 ti muntu yina kesadisaka TNFα. Ata TNFα kele ti bisalu ya kufwa tumor mpi ya kufwa tumor, na kansere ya divumu, TNFα lenda sadisa kansere ya divumu na kuyela (31-33). Kufwa ya TNFα na culture ya baselile ya tumeur ya ovaire to kukatula kidimbu ya TNFα na bambandu ya mpuku lenda tomisa kusalama ya ba cytokine ya kuvimba yina ke katukaka na TNFα mpi kukanga nzila na kuyela ya tumeur ( 32 , 35 ). Na yina, na mutindu yayi, MNA yina me katuka na TME lenda sala mutindu kima yina ke sadisaka na kuvimba na nzila ya nzila mosi ya ke sadisaka TNFα na nzila ya nzila ya autocrine, ebuna yo ke sadisaka na kubasika mpi kumwangana ya kansere ya divumu ( 31 ). Na kutadila mpila yai, bo ke na kulonguka mutindu ya kukanga TNFα bonso nkisi yina lenda belula kansere ya divumu ( 37 , 48 , 49 ). Diaka, ADN ke bebisaka ngolo ya baselile ya CAR-T yina ke fwaka baselile ya tumeur ya ovaire, mpi yo ke pesaka banzikisa ya nkaka ya ke monisa nde ADN ke kangaka ngolo ya nitu. Na kimvuka, bamvutu yai ke pesa ngindu ya mbandu mosi yina ba tumeurs mpi baselile ya CAF ke basisaka ADN na TME yina kele na nganda ya baselile. Na nzila ya (i) kupesa ngolo na kuyela ya kansere ya divumu yina kekatukaka na TNF mpi (ii) kubuyisa kisalu ya baselile T yina kefwaka ba cellule T yina kekatukaka na ADN, yo lenda vanda ti bupusi ya zole ya tumeur (Kifwanisu 5D).
Na nsuka, na kusadilaka kimvuka ya kutunga baselile nswalu, kulandana ya baselile mosi mpi kuzaba mutindu nitu ke tambulaka, kulonguka yai monisaka luswaswanu ya nene ya ke tadila mutindu nitu ke sadisaka nitu na kukangama ngolo na nitu na kati ya baselile ya tumeur mpi ya baselile ya ascite na bambefo ya HGSC. Kufimpa yai ya mvimba monisaka nde kele ti luswaswanu na yina me tala kubaka sukadi mpi kisalu ya mitokondrie na kati ya baselile T, mpi yo monisaka nde MNA kele kima mosi ya ke twadisaka nitu yina ke twadisaka nitu mpi yina ke salaka yo mosi ve. Bansangu yai kele ti bupusi na mutindu TME ke vandaka ti bupusi na mutindu baselile T ke balulaka bima na kansere ya bantu. Ata bo metubilaka kutesana ya mbala mosi sambu na madya na kati ya baselile T ti baselile ya kansere, bima yina kevandaka na kati ya nitu lenda sala mpi bonso bima yina ketwadisaka mambu na mutindu mosi ya kukonda kukana sambu na kusadisa tumeur na kuyela mpi ziku kukanga bamvutu ya nitu yina kekatukaka na nitu. Ntendula ya nkaka ya kisalu ya ba metabolites yai ya ke twadisaka lenda kangula mayele ya nkaka sambu na kutomisa mvutu ya nitu yina ke nwanaka ti tumeur.
Bau bakaka ba échantillons ya ba mbefo mpe bansangu ya kimbevo na nzila ya kisika ya kubumba mikanda ya kansere ya BC yina me ndimama na Réseau ya kubumba mikanda ya Canada. Na kutadila mutindu yina bo me ndimaka na Komite ya Bikalulu ya Bansosa ya Kansere ya BC mpi na Iniversite ya Colombie-Britannique (H07-00463), ba-échantillon yonso ya bambefo mpi bansangu ya kimunganga kubakaka nswa ya kusonika to bo yambulaka nswa na bo na mutindu ya me fwana. Bau ke bumbaka ba mbandu na Biobanque (BRC-00290) yina me ndimama. Bikalulu ya mbefo ya fioti-fioti me monisama na ba Tableau S1 na S5. Sambu na kutanina yo na tiya, bo ke sadilaka bistoire sambu na kufwa na mutindu mosi ya mekanika bima yina bo me baka na nitu ya mbefo mpi na nima bo ke pusaka yo na nzila ya filtre mosi ya kele ti bamikro 100 sambu na kubaka selile mosi mpamba. Bau vandaka kutula ascite ya mbefo na 1500 rpm na nsungi ya miniti 10 na 4°C sambu na kukanga baselile mpi kukatula masa yina vandaka na zulu na yo. Ba cellules yina ba bakaka na tumeur mpe na ascite, ba bumbaka yau na kati ya 50% ya menga ya muntu yina me katuka na tiya (Sigma-Aldrich), 40% ya RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) mpe 10% ya menga ya diméthyle. Bo vandaka kuyoka bima yai ya bo me bumbaka na baselile mosi mpi bo vandaka kusadila yo sambu na kuzaba bima yina ke vandaka na kati ya nitu mpi mutindu bo ta tubila yo na nsi.
1640: AimV. 1640 + 2,05 mM ya l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) yina bo me yika ti 10% ya menga ya AB ya muntu yina bo me katulaka na tiya (Sigma-Aldrich), 12,5 mM ya Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM ya l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Nkisi ya ke sadisaka na kubelula maladi ya ntu (PenStrep) mpi 50 μMB ya mercaptoéthanol. AimV (Invitrogène) ke yikamaka na 20 mM ya Hepes (Kima ya ke sadisaka na kukanga tiya) mpi 2 mM ya l-glutamine (Kima ya ke sadisaka na kukanga bima na tiya). 10:10, 11. 10 Kuvanda ti 0,22 μm ya masa ya mungwa ya kuyoka (PBS; Invitrogène) yina bo me yika na 3% ya menga ya muntu ya AB yina bo me katulaka na tiya (Sigma). Tampon ya kutunga baselile kele ti PBS ya bo me filtrer na 0,22μm mpi bo me yika yo ti 0,5% ya menga ya muntu yina bo me katulaka na tiya (Sigma-Aldrich).
Na 37°C ya mvimba, bo tulaka baselile na 10 nM ya DR MT mpi 100 μM ya 2-NBDG na nsungi ya miniti 30. Na nima, bo tulaka baselile yina mukubu ya eF506 yina ke sadisaka na kuzinga na 4°C na nsungi ya miniti 15. Kuvutula baselile na Bloque FC (eBioscience) mpe na tampon ya kutula mukubu ya ke sema (BD Biosciences), kuyobisa yau na tampon ya kutula mukubu ya cytomètre ya flux (na kulandaka bantuma ya muntu yina salaka yau), mpe kutula yau na kati ya miniti 10 na tiya ya kisika. Kutula mukubu na baselile na kimvuka ya bima yina ke taninaka nitu (Tableau S2) na kati ya tampon ya kutula mukubu na 4°C na nsungi ya miniti 20. Kuvutula baselile na kati ya tampon ya kutula mukubu ya cytométrie ya flux (Cytek Aurora; ngidika ya 3L-16V-14B-8R) na ntwala ya kusala bansosa. 10:10, 11. 10 Sadila SpectroFlo mpi FlowJo V10 sambu na kutadila bansangu ya ntalu ya baselile, mpi sadila GraphPad Prism 8 sambu na kusala bansangu yina. 2-NBDG mpe MT DR vuandaka na mutindu ya kufwanana, mpe na manima basadilaka test t zole samu na kufiongunina ba ntalu samu na kupesa mvutu na ba mbefo yina vuandaka mutindu mosi. Katula ba ntalu nyonso ya bantu yina kele na mambu ya kusalama na nsi ya 40 na kati ya lusalusu; kotisa ntalu ya IMF ya 1 samu na konso ntalu ya yimbi na ntwala ya kusala lusalusu ya ba ntalu mpe kutala ba nsangu.
Na nsadisa ya ngidika ya kukanga bakielo na maboko ya panele ya bisalu yina kele na zulu, beto sadilaka bantendula ya mvimba na nzila ya nti ya kukanga bafoto (FAUST) (21) sambu na kupesa baselile na mbala mosi na kimvuka ya bantu na nima ya kukatula baselile ya kufwa na FlowJo. Beto ke twadisaka na maboko bima yina ke basikaka sambu na kuvukisa bimvuka yina ke monana nde bo me kabulaka yo ve mbote (kuvukisa PD1+ ti baselile ya PD1-tumeur) mpi bimvuka yina bo me bumba. Konso mbandu kele na mwayene ya baselile kuluta 2%, sambu na kimvuka ya bantu 11.
Bau sadilaka nzila ya kukabula PBMC na bima ya kukabula baselile ya menga (Bateknolozi ya STEM). Bau katulaka baselile ya CD8 + T na PBMC na kusadilaka ba CD8 ya fioti (Miltenyi) mpe bau kumisaka yau nene na kati ya mvingu ya bantu na kusadilaka TransAct (Miltenyi) na ba mposo 2 na kulandaka bantuma ya muntu yina salaka yau. Bau bikaka baselile yina kutelama bilumbu 5 na kati ya kisika ya mvimba yina kele na IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), na nima bau vutulaka yau ngolo na nsadisa ya TransAct. Na kilumbu ya 7, na kutadila bantuma ya muntu yina salaka yo, bo sadilaka bima ya fioti-fioti yina bo ke bingaka CD45 (Miltenyi) ya bantu sambu na kukumisa baselile ngolo na ba round tatu ya kulandana. Bau katulaka baselile samu na kufiongunina yau na nsadisa ya cytométrie de débit (mutindu beto me tubila yau na zulu), mpe bau katulaka baselile milio mosi mbala tatu samu na kufiongunina yau na nsadisa ya LC-MS/MS. Ba mbandu yina ba me sala na nzila ya LC-MS/MS mutindu ba me tubila yau na nsi. Beto me yindula nde ntalu ya bima yina ke vandaka na kati ya nitu kele ve ti ntalu ya ba ion 1 000. Konso mbandu ke tambulaka na nzila ya ntalu ya ba ion ya mvimba (TIC), ke balusamaka na nzila ya logarithme mpe ke vutulamaka na nzila ya mvingu ya bantu na ntwala ya kufiongunina.
Bau vandaka kuyoka masa ya selile mosi ya konso mbefo mpi kuyoka yau na nsadisa ya filtre ya 40 μm na kati ya ntoto ya mvimba (mutindu beto me tubila yau na zulu). Na kutadila mutindu ya kusadila yina muntu salaka, ba nzietolo tatu ya kulandana ya kupona ya mbote na nzila ya kukabula ba mbuma ya ngolo na kusadilaka ba mbuma ya fioti (Miltenyi) samu na kutomisa ba mbandu samu na ba cellule CD8+, CD4+ mpe CD45- (na zulu ya glace). Na bunkufi, bo ke vutulaka baselile na kati ya tampon ya ke kumisaka baselile ngolo (mutindu beto me tubila yo na zulu) mpi bo ke tangaka yo. Bau tulaka baselile na kati ya ba mbuma ya CD8 ya muntu, ba mbuma ya CD4 ya muntu to ba mbuma ya CD45 ya muntu (Miltenyi) na 4°C na miniti 15, na nima bau sukulaka yau na tampon ya kutunga baselile. Bau ke lutisaka mbandu na nzila ya nzila ya LS (Miltenyi), mpe bau ke vukisaka bitini ya mbote mpe ya yimbi. Sambu na kukulumusa ntangu mpi kukumisa ngolo kitambi ya kuvutula baselile, na nima bo kesadilaka kitini ya CD8 sambu na nziunga ya zole ya kukumisa CD4+ ngolo, mpi bo kesadilaka kitini ya CD4 sambu na kukumisa CD45 ngolo na nima. Beno bumba solution na zulu ya glace na ntangu yonso ya beno ke kabula.
Samu na kubongisa ba mbandu samu na kufiongunina ba metabolite, ba sukulaka ba cellule mbala mosi na masa ya mungwa ya madidi ya glace, mpe ba yikaka ml 1 ya méthanol 80% na konso mbandu, na manima ba vutulaka yau na zulu mpe ba tulaka yau na masa ya azote ya masa. Bau tulaka ba échantillons na ba cycle tatu ya congélation-dégel mpe bau tulaka bau na centrifuge na vitesi ya 14 000 rpm na nsungi ya miniti 15 na 4°C. Bo ke katulaka masa yina kele na zulu ya bima yina ke balulaka nitu tii kuna yo ke yumaka. Bau ke vukisaka diaka bima yina ke vutukaka na kati ya 50 μl ya acide formique 0,03%, bau ke vukisaka yau samu na kuvukisa yau, mpe na manima bau ke vukisaka yau na kati samu na kukatula bima ya mvindu.
Kukatula ba metabolite mutindu beto me tubila yo na zulu. Tula masa yina kele na zulu na mulangi ya masa ya ke salaka mbote sambu na kusala bansosa ya ke tadila bima yina ke vandaka na kati ya nitu. Sadila mutindu ya kusansa na mutindu ya kukonda kukana sambu na kusansa konso mbandu ti ntalu ya baselile ya mutindu mosi sambu na kubuyisa bampasi ya kimvuka. Beto salaka lusalusu ya mbote ya bima yina ke balukaka na ntoto ya mvimba yina bo basisaka ntete na zulu ya zulunalu mosi (50). Kufiongunina ya mvingu ya bantu mpe kuvukisa bisika ya zulu me salama na kusadilaka logiciel MultiQuant version 2.1 (Biosystèmes appliqués SCIEX).
Ba sadilaka ntalu ya ba ion ya 1000 samu na kuzaba ntalu ya bima yina ke konda, mpe ba sadilaka TIC ya konso mbandu samu na kuzaba kisika ya zulu ya konso kima yina ba me mona samu na kubongisa ba nsobolo yina me kota na nzila ya analyse ya bisadilu yina me katuka na kisalu ya kusadila bima. Na nima ya kutula TIC na kisika na yo, bo ke sadilaka parametre ya ntete sambu na kubalula mambu na mutindu ya logarithme mpi kuyidika nzila ya norme na mutindu mosi ya kukonda kuyindula. Beto sadilaka PCA na paquet R ya vegan samu na kusala lusalusu ya kusosa kuzaba luswaswanu ya metabolome na kati ya mitindu ya ba mbandu, mpe sadilaka lusalusu ya redondance ya ndambu samu na kufiongunina ba mbefo. Sadila mutindu ya Ward samu na kutunga dendrogramme ya karte ya tiya samu na kuvukisa ntama ya Euclide na kati ya ba mbandu. Beto sadilaka limma (52) na yina me tala ntalu ya bima yina ke sadisaka na nitu sambu na kuzaba bima yina ke sadisaka na nitu yina kele na mutindu ya kuswaswana na mutindu ya baselile yonso mpi na kisika yina bo ke zingaka. Samu na ku pesa ntendula ya pete, beto ke sadila parametre ya moyenne ya kimvuka samu na ku monisa mbandu, mpe kutadila mitindu ya ba cellule na kati ya micro-environnement mutindu konso kimvuka (n = bimvuka 6); samu na kumeka ya mfunu, beto salaka ba mesure tatu ya mbala na mbala samu na konso metabolite Samu na kubuya kuvutukila ya luvunu, ba kotisaka mbefo mutindu kigonsa na mutindu ya kutunga limma. Samu na kutala luswaswanu ya ba metabolites na kati ya ba mbefo ya kuswaswana, beto yidikaka mbandu ya limma yina ke vukisaka ba mbefo na mutindu mosi ya kukangama. Beto ke pesa rapore ya mfunu ya luswaswanu yina bo me tubila na ntwala na kati ya mutindu ya selile ti kisika ya fioti ya Padj <0,05 (kusungika ya Benjamini-Hochberg).
Na nima ya kutunga ngolo na kusadilaka Kit ya kukatula baselile ya kufwa ya Miltenyi (>80% ya luzingu), bo salaka kulandana ya baselile mosi na zulu ya ba échantillons ya ascite mpi ya tumeur yina bo me kangaka na masa ya ke zingaka na kusadilaka protocole ya kumonisa ba gène 10x 5′. Bau tadilaka mambu tanu yina vandaka ti ba tumeur ti ascite yina vandaka kufwanana, ata luzingu ya fioti yina katukaka na échantillon mosi ya tumeur kangaka nzila na kukotisa yau. Samu na kuzwa ba nsololo mingi ya ba mbefo, beto vukisaka ba mbandu ya konso mbefo na ba nzila ya 10x ya chrome, mpe beto fimpaka bisika ya ascite mpe ya tumeur mosi mosi. Na nima ya kutula ndonga [Nsuka ya zole ya 28×98 bp (PE), génome ya Québec; (53) (yina me simbama na CellSNP bonso SNP ya bantu yonso (VCF) yina GRCh38 ke pesaka ke bakaka kimuntu ya muntu yina ke pesaka menga. (IBS), katula baselile yina bo me pesa ve mpi baselile yina bo me zaba nde yo kele ba-duplexe mpi ba-donateur yina ke wakana na kati ya ba-échantillon ya ascite mpi ya tumeur (54) Na nsadisa ya kisalu yai, beto bumbaka mambu tatu yina vandaka ti baselile mingi yina vandaka na kati ya tumeur mpi ya tumeur sambu na kusala bansosa na zulu ya masa (Sc5. 6975 (baselile 2792 mpi baselile 4183 ya me katuka na tumeur mpi na ascite, na kulandana) sambu na kusala bansosa Beto ke sadilaka kimvuka ya Louvain ya réseau ya pene-pene ya bo me kabulaka (SNN) yina me simbama na kitamina ya Jaccard na baselile ya kimvuka na nzila ya bangogo yina bo me sonikaka na maboko. mpi yina bo ke monaka na meso ti t-SNE, bo ke tendulaka yo na nzila ya CD8A mpi ya GZMA, katula kaka bimvuka ya fioti yina kele ti baproteine ​​ya ribosome ya fioti (16), yika mpi mutindu bo ke kotisaka baselile ya t-SNE.
Bau kabulaka PBMC na bima ya kukabula baselile ya menga (Bateknolozi ya STEM) na nzila ya nzila ya Ficoll ya kukangama na zulu ya masa. Bau katulaka baselile ya CD3 + na PBMC na kusadilaka bambuma ya CD3 (Miltenyi). Na ntwala to ve ya ADN, bo vandaka kusala baselile ya CD3+ ti CD3 yina me kangama na baplaque (5 ml/ml), CD28 yina ke lembaka (3 ml/ml) mpi IL-2 (300 U/ml; Proléucine). Na kilumbu ya nsuka ya kuyedisa, bo tadilaka mutindu ya kuzinga (Couleur de vie fixable eFluor450, eBioscience) mpi mutindu ya kuyela (bambuma ya 123, siansi ya Thermo Fisher Scientific) na nzila ya cytométrie de flux. Kutadila kisalu ya effecteur na kupesaka baselile ngolo ti PMA (20 ng/ml) mpi ionomycine (1 μg/ml) ti GolgiStop na nsungi ya bangunga 4, mpi kulanda CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) mpi TNFore (Mb11, BD). Kupesa ngolo na baselile ya qPCR mpe ya ChIP na PMA (20 ng/ml) mpe ionomycine (1μg/ml) na bangunga 4. Bau vukisaka masa ya ELISA na ntwala mpe na manima ya kupesa ngolo na PMA (20 ng/ml) mpe ionomycine (1 μg/ml) na bangunga 4.
Landa mambu yina muntu yina salaka yo ke tubaka sambu na kukatula ARN na kusadilaka Kit ya fioti ya RNeasy Plus (QIAGEN). Sadila QIAGEN sambu na kuvukisa bima yina bo me baka. Sadila kit ya ARN na ADN ya ngolo mingi sambu na kuvukisa ADN ya kufwanana (ADN). Sadila TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) sambu na kuzaba ntalu ya bima yina ke basikaka na nitu (na kutadila mutindu muntu yina salaka yo ke tubaka) ti ba sonde yai: 10:10, 11. 10 Kukonda kuzaba mambu mingi ya me tala glycéraldehyde-3-phosphate (GAPDH) mpi 1010726 m1 (SLC22A2). Bau salaka ba mbandu na nzila ya ngidika ya PCR ya ntangu ya kyeleka ya StepOnePlus (Banzila ya kusadila) na kati ya plaque ya réaction optique ya nswalu ya MicroAmp (Banzila ya kusadila) ti filme ya kutala ya MicroAmp. Konso ntalu ya Ct yina meluta 35, bo ketangaka yo bonso nde yo kele na zulu ya ndilu ya kuzaba mpi bo ketulaka kidimbu nde yo lenda zabana ve.
Sala ChIP mutindu bo me tubila yo na zulu (58). Na bunkufi, bo tulaka baselile yina ti formaldehyde (kiteso ya nsuka 1,42%) mpi bo tulaka yo na tiya ya nzo na nsungi ya miniti 10. Sadila tampon ya kuvimba yina bo me yika (25 mM ya Hepes, 1,5 mM ya MgCl2, 10 mM ya KCl mpi 0,1% ya NP-40) na zulu ya glace na nsungi ya miniti 10, na nima tula yo diaka na tampon ya kuvimba mutindu bo me tubila yo (58 ). Na nima, bo salaka sonika na mbandu yina ti banzietelo yai: banzietelo 10 (bapulse 20 ya sekondi mosi) mpi ntangu ya kukonda kusoba ya basegonde 40. Kuvukisa ba anticorps ya immunoglobuline G (Teknolozi ya kupesa bidimbu na baselile; 1μl), histone H3 (Teknolozi ya kupesa bidimbu na baselile; 3μl), NFAT (Invitrogène; 3μl) mpi SP1 (Teknolozi ya kupesa bidimbu na baselile; 3μl) na zulu ya CC°4 Kuvukisa ba mbuma ya proteine ​​A ( Thermo Fisher Scientific ) na échantillon na 4°C na kunikisa malembe na ngunga 1, na manima kusadila ba mbuma ya chelex (Bio-Rad) samu na kutomisa ADN, mpe kusadila proteinase K samu na kudia ba proteine. Bau monaka nsangu ya TNFα na nzila ya PCR: na ntwala, GGG TAT TGT TGT TGT; kansi, GTG ATA ATA TG (kima ya kele ti 207 bp). Bifwanisu yina salamaka na Laboratoire ya Bifwanisu (Bio-Rad) mpe ba pesaka ntalu na yau na kusadilaka logiciel ImageJ.
Bau vukisaka bima yina bikalaka na zulu ya culture ya baselile mutindu beto me tubila yau na zulu. Bau salaka kuzaba mambu yina na kulandaka mutindu yina muntu yina salaka bima yina ke sadisaka na kuzaba kana muntu kele ti maladi ya TNFα (Invitrogen), bima yina ke sadisaka na kuzaba kana muntu kele ti IL-2 (Invitrogen) mpi bima yina ke sadisaka na kuzaba kana muntu kele ti IFN-γ (Abcam). Na kutadila mutindu muntu yina salaka yo ke tubaka, bo vandaka kuyoka masa yina vandaka na zulu ya masa yina na kiteso ya 1:100 sambu na kuzaba TNFα mpi IL-2, mpi masa ya 1:3 sambu na kuzaba IFN-γ. Sadila kisadilu ya ke tangaka bima mingi (PerkinElmer) sambu na kutesa ngolo ya masa yina ke bakaka masa na 450 nm.
Bau kabulaka PBMC na bima ya kukabula baselile ya menga (Bateknolozi ya STEM) na nzila ya nzila ya Ficoll ya kukangama na zulu ya masa. Bau katulaka baselile ya CD3 + na PBMC na kusadilaka bambuma ya CD3 (Miltenyi). Na ntwala to ve ya ADN, baselile ya CD3+ vandaka kusala ti CD3 yina me kangama na baplaque (5μg/ml), CD28 yina ke lembaka (3μg/ml) mpi IL-2 (300 U/ml; Proléucine) na nsungi ya bilumbu 3. Na nima ya bilumbu 3, bau ke vukisaka ba cellule mpe bau ke sukulaka yau na 0,9% ya masa ya mungwa, mpe bau ke kangaka pellet na mbala mosi. Bau salaka kutanga ya baselile na nsadisa ya cytométrie de flux (Cytek Aurora; ngidika ya 3L-16V-14B-8R) na kusadilaka ba-eBeads ya kutanga 123.
Kukatula ba metabolite mutindu beto me tubila yo na zulu. Bau ke vutulaka bima ya kuyuma na kitezo ya 4000 ya ba cellule/μl. 1290 Infinity II, Agilent Technologies, CA) mpe nzila ya CORTECS T3 (2,1×150 mm, nene ya bitini 1,6-μm, nene ya ba pore 120-Å; #186008500). 6470, Agilent, na kati na yau ionisation ya kura kesala na mutindu ya mbote. Fase ya kutambula A kele 0,1% ya aside formique (na H2O), fase ya kutambula B kele 90% ya aside formique, 0,1% ya aside formique. Kutambula ya LC kele na miniti 0 ti 2 samu na 100% A, miniti 2 tii na 7,1 samu na 99% B, mpe miniti 7,1 tii na 8 samu na 99% B. Na manima, vutula na kitezo ya ntuala na fase A ya kutambula na vitesi ya 0,6 ml/min na miniti tatu. . Kuluta ya masa kele 0,4ml/min, mpe kisika ya ntuala ke tula tiya na 50°C. Sadila norme ya kimunganga ya mpembe ya MNA (M320995, Société chimique de recherche de Toronto, York du Nord, Ontario, Canada) samu na kutula ntangu ya kubumba (RT) mpe ya kubalusa (RT = miniti 0,882, kubalusa 1 = 137→94,1, kubalusa 2 = 137, kubalusa →373). Kana ba nsinsani nyonso tatu ke salama na ntangu ya kubumba ya mbote, ba nsinsani 1 ke sadilama samu na kuzaba ntalu samu na kuzaba mambu ya sikisiki. Ba nsangu ya mvingu ya bantu (Société chimique de recherche de Toronto) me salama na ba nsangu sambanu ya mvingu ya bantu (1 mg/ml) samu na kuzwa ba nsangu ya 0,1, 1,0, 10 mpe 100 ng/ml mpe 1,0 mpe 10 μg/ml ya masa. Nsuka ya kuzaba kele 1 ng/ml, mpe mvutu ya nzila kele na kati ya 10 ng/ml na 10 μg/ml. Konso ntunga ya ba microlitre zole ya échantillon mpe ya norme ke sadilamaka samu na kufiongunina LC/MS, mpe échantillon ya kuvukisa ya kutala mbote ke tambulaka na nima ya ba ntunga nana samu na kuzaba mbote mbote plateforme ya kufiongunina. Ba mvutu ya MNA ya ba échantillons nyonso ya ba cellule yina ba me sadila MNA vuandaka na kati ya nzila ya nzila ya test. Kufiongunina ba nsangu me salama na kusadilaka logiciel ya kufiongunina ntalu ya bantu (v9.0, Agilent).
Kutunga ya αFR-CAR ya ndonga ya zole bakamaka na Nkunga na bankaka. (59). Na bunkufi, kima yina bo me tunga kele ti mambu yai: ndonga ya bamfumu ya CD8a, kitini ya αFR ya muntu yina ke sobaka na nzila mosi, charnière ya CD8a mpi kisika yina ke lutaka na kati ya baselile, kisika ya CD27 yina kele na kati ya baselile mpi kisika yina kele na kati ya baselile ya CD3z. Bau salaka ndonga ya mvimba ya CAR na nzila ya GenScript, mpi na nima bau salaka yau na kati ya vecteur ya lentivirus ya ndonga ya zole yina kele na zulu ya kaseti ya GFP yina bau sadilaka sambu na kutadila mutindu ya kubalula nsangu.
Bo ke basisaka lentivirus na nzila ya kutula baselile ya HEK293T [Kimvuka ya Bifwanisu ya Bantu ya Amerika (ATCC); 10% ya menga ya ngombe ya mwana yina kele na divumu (FBS) mpi 1% ya menga ya ngombe yina kele na divumu, mpi bo sadilaka vecteur CAR-GFP mpi Ba plasmide ya kukanga bima (psPAX2 mpi pMD2.G, Addgene) ke sadilaka amine ya ke sadisaka na kukanga mafuta. Bau bakaka masa yina vandaka na zulu ya virisi bangunga 48 ti 72 na nima ya kubalula yau, bau filtraka yau, mpe bau vukisaka yau na nsadisa ya ultracentrification. Bumba masa ya virisi yina me vukana na -80°C tii kuna yo ta baluka.
Bau ke kabulaka ba PBMC na bima ya kukabula ba menga ya menga ya mbote (ba teknolozi ya STEM) na nzila ya nzila ya Ficoll. Sadila ba mbuma ya fioti ya CD8 ya kupona ya mbote (Miltenyi) samu na kukatula ba mbuma ya CD8+ na PBMC. Kupesa ngolo na baselile ya T na nsadisa ya TransAct (Miltenyi) mpi na kati ya TexMACS [Miltenyi; bo ke yikaka yo ti 3% ya menga ya muntu yina bo me katulaka na tiya, 1% ya menga ya muntu yina ke salaka ve kisalu mpi IL-2 (300 U/ml)]. Bangunga makumi zole na iya na nima ya kupesa nsudi, bo tulaka baselile T na lentivirus (10 μl ya masa ya virisi ya kukangama na baselile 106). 1 tii na 3 bilumbu na nima ya kubalula na Cytek Aurora (na FSC (Kupanzana na Ntwala)/SSC (Kupanzana na Balweka), na Singlet, na GFP+), kutadila mutindu GFP ke basikaka na baselile sambu na kumonisa nde yo ke sadisaka na kubalula ata 30% .
Bau ke kunaka baselile ya CAR-T na bangunga 24 na kati ya Immunocult (ba tekinolozi ya stemcell; bau ke yikaka yau na 1% ya PenStrep) na ba mambu yayi: bau ke sadilaka yau ve, bau ke sadilaka yau 250 μM ya adenosine to 10 mM ya ADN. Na nima ya kusadila yo ntete, bo yobisaka baselile ya CAR-T ti PBS mpi bo vukisaka yo ti baselile 20 000 ya SK-OV-3 [ATCC; 10:10:10, 11. 10: Bau kumisaka ngolo na mbala tatu na kati ya bima yina bo yikaka ti Immunocult. Bau sadilaka baselile ya SK-OV-3 ti baselile ya SK-OV-3 yina bo me vukisaka ti saponine ya digitalis (0,5mg/ml; Sigma-Aldrich) bonso bima ya ke tadila mambu ya mbi mpi ya mbote. Na nima ya bangunga 24 ya kukuna na kimvuka, bau ke vukisaka masa yina me bikala na zulu ya masa mpe bau ke tesaka kitezo ya mvingu ya bantu (LDH) na kulandaka bantuma ya muntu yina salaka yau (Kit d’essai de l’cytotoxicité gloire de l’LDH, Promega). Bo vandaka kutula masa ya LDH yina vandaka na zulu ya masa na 1:50 na tampon ya LDH. Bau tesaka ntalu ya kufwa na kusadilaka formule yayi: ntalu ya kufwa = ntalu ya kusungika / ntalu ya kufwa ya kulutila x 100%, kisika ntalu ya kufwa ya kulutila = ba cellules T ya co-culture kaka, mpe ntalu ya kufwa ya kulutila = lusadusu ya mbote-luyalu ya yimbi.
Mutindu ba me tubila yau na masonama to bima mpe ba nzila, sadila GraphPad Prism 8, Microsoft Excel to R v3.6.0 samu na kufiongunina ba ntalu. Kana ba échantillons mingi me bakama na mbefo mosi (bonso ascite mpe tumeur), beto ke sadilaka test t ya zole to kukotisa mbefo mutindu effet ya mpamba na mbandu ya nzila mosi to ya mvimba mutindu me fwana. Samu na kufiongunina bima ya nzutu, ba ke salaka kizama ya mfunu na ba mbala tatu.
Sambu na kuzwa bima ya nkaka sambu na disolo yai, tala http://advances.
Yai kele disolo mosi ya bantu yonso lenda kota mpi bo me kabulaka yo na nsi ya bansiku ya Nswa ya Kupesa Bima-Kukonda Kusala Bisalu, yina ke pesaka nswa ya kusadila, kukabula mpi kubasisa yo na konso mutindu yina, kana kusadila ya nsuka kele ve sambu na mbongo ya mumbongo mpi kana lukanu kele nde kisalu ya kisina kele ya mbote. Referansi.
Noti: Beto ke lomba nge kaka na kupesa adresi na nge ya e-mail sambu muntu yina nge ke pesa zina na yandi na lutiti kuzaba nde nge ke zola nde yandi mona e-mail yina mpi nde yo kele ve e-mail ya mbi. Beto ta kanga ve ata adresi mosi ya ba e-mail.
Ngiufula yai ke sadisamaka sambu na kumeka kana nge kele munzenza mpi kukanga nzila na kutinda bansangu ya mbi na mbala mosi.
Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusel G. Jones), Finasi T.
MNA ke sadisaka na kukanga baselile T yina ke taninaka nitu mpi yo ke monisaka mutindu mosi ya bo lenda sadila sambu na kubelula kansere ya muntu.
Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusel G. Jones), Finasi T.
MNA ke sadisaka na kukanga baselile T yina ke taninaka nitu mpi yo ke monisaka mutindu mosi ya bo lenda sadila sambu na kubelula kansere ya muntu.
©2021 Kimvuka ya Amerika sambu na Kuyela ya Siansi. banswa yonso kele ya bo me bumba. AAAS kele nduku ya HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CroixRef mpi COMPTEUR. 2375-2548.