Kupona ba proteine ​​na nzila ya kubasisa menga kele mfunu sambu na kutanina mutindu baselile ke kabulaka mpi mutindu baselile ke vandaka mbote. Katula kupona na nsadisa ya mpusu ya nitu, kisalu ya mafuta na kupona ya kinesine na nzila ya kunata bima yina ke basikaka na nitu kele ngyufula ya mfunu yina me salaka bamvula mingi mpi yina bo me pesa ntete ve mvutu. Awa, beto ke salaka bifwanisu ya 3D ya mikubu mingi na mbala mosi sambu na kumonisa na luzingu nde baproteine ​​ya mpa ya bo me vukisa ti bitini ya mafuta ya ceramide ya nda kibeni ke vukanaka mpi ke kabuanaka na ba endoplasme ya sipesiali na nzila ya kisika ya kubasika ya proteine ​​yina. Na zulu ya mambu yai, beto ke monisa nde nda ya nsinga ya ceramide na kati ya nsinga ya endoplasme kele mfunu mingi sambu na kupona yai ya kupona. Kulonguka na beto ke pesa nzikisa ya ntete ya mbala mosi na luzingu sambu na kutula na ndonga bima ya proteine ​​na kutadila nda ya nsinga ya mafuta na bisika ya kupona ya kubasisa masa na nzila ya kubasisa masa.
Na baselile ya eucaryote, na nima bo ke ponaka baproteine ​​yina bo me vukisaka na réticule endoplasmique (ER) ntangu bo ke nataka yo na nzila ya ke basisaka masa sambu na kunata yo na kisika ya me fwana yina yo fwete kwenda (1). Na zulu ya kupona na nzila ya mpusu, bo vandaka kuyindula banda ntama nde mafuta yankaka lenda sala mpi bonso bisika ya kubasika ya kupona na kuvukisaka yo na bisika ya sikisiki ya membrane yina baproteine ​​ya sikisiki (2-5). Kansi, nzikisa ya mbala mosi ya in vivo kele kaka ve sambu na kumonisa mutindu yai ya lenda salama na nzila ya mafuta. Na nima ya kumanisa diambu yai ya mfunu, beto longukaka na levire mutindu baproteine ​​yina ke kangamaka na ER (GPI) ke basikaka na mutindu ya kuswaswana na ER. Ba GPI-AP kele mitindu ya kuswaswana ya baproteine ​​yina kele na zulu ya baselile yina ke vukanaka ti mafuta ( 6, 7 ). GPI-AP kele proteine ​​mosi ya ke basikaka yina ke kangamaka na mikanda ya nganda ya menga na nzila ya kitini ya glycolipide ( ancre ya GPI ). Bau ke ndimaka ba nsinga ya GPI bonso bansoba ya ke taninaka na nima ya kubalula na lumière ya ER (8). Na nima ya kukangama, GPI-AP ke lutaka na nzila ya kisadilu ya Golgi (5, 9) katuka na ER mpi ke kumaka na kati ya nsinga ya menga. Kuvanda ya ba nsinga ya GPI ke salaka nde GPI-AP kunatama na mutindu ya nkaka ti ba proteine ​​yina ke basikaka na nzila ya misisa (tanga mpi ba proteine ​​ya nkaka ya ke basikaka na nzila ya plasma) na nzila ya kubasisa masa (5, 9, 10). Na baselile ya levire, bo ke katulaka ba GPI-AP ti baproteine ​​ya nkaka yina ke basikaka na kati ya réticule endoplasmique, mpi na nima bo ke kangaka yo na ba vesicule ya kuswaswana yina bo me ziunga ti baproteine ​​ya nkaka ya ke basikaka na nitu ( 6, 7 ). Ba mambu ke pesa nzila na nzila yayi ya ku tula na ndonga na nzila ya ku tinda ER na nganda ya yinsi kele ya ku zabana ve, kansi ba ke banza ti nzila yayi lenda lomba mafuta, mingi mingi ku yidika diaka ntungulu ya kitini ya mafuta ya nsinga ya GPI (5, 8). Na levire, kuyidika dyaka mafuta ya GPI keyantikaka mbala mosi na nima ya GPI kukangama, mpi bantangu mingi, yo kesalaka nde ceramide kukangama na acide gras saturé ya kele ti nsinga ya nda ya 26 carbone (C26:0) (11, 12). C26 kele ceramide ya ntete yina baselile ya levire ke basisaka tii bubu yai. Yau kevukanaka na ER mpe mingi na kati na yau kekwendaka na nzila ya bima ya Golgi na nzila ya ba nsinga ya COPII (13). Kubasisa ER ya GPI-AP kelombaka mpenza kusala kisalu ya kulandana ya kusala bima ya mpa (14, 15), mpi na nima, kubalula bima ya mpa na kusala bima ya ngolo (IPC) na kati ya kisadilu ya Golgi ketadila kusala kisalu ya kusala bima ya ngolo (16). Bakulonguka ya biofiziki ti bamembrane ya bantu mesalaka memonisaka nde ba ceramide ya nsinga ya acyl ya nda mingi lenda vukana sambu na kusala bisika ya bo metulaka na ndonga yina kele ti bikalulu ya nitu ya kuswaswana ( 17, 18 ). Ba nsangu yai kenataka na ngindu nde C26 ti GPI-AP ti C26 kesadilaka bikalulu na bo ya kinsuni sambu na kuvukana na bisika to bisika yina kele na ndonga na kisika ya mafuta ya ER yina kele mwa mvindu. Yo ke vandaka mingi-mingi ti ba glycérolipides ya nkufi mpi ya kukonda masa (C16:1 mpi C18:1) (19, 20). Ba régions yayi ke pona na ba nzila ya kubasika ya ER (ERES) ya sikisiki, kisika yina ba lenda nata GPI-AP ya ceramide mpe ya ceramide na Golgi na kati ya vesicule mosi ya COPII yina me kudipesa (5).
Na kulonguka yai, beto me meka mbala mosi mutindu yai ya kusadila mafuta na kusadilaka mikroskopi ya ntangu ya kieleka (SCLIM), yina kele mayele ya mpa ya kutala bifwanisu yina lenda tala na mbala mosi baproteine ​​yina kele ti bidimbu ya ke sema. (21, 22).
Beto sadilaka ntete teknolozi ya SCLIM sambu na kutendula diaka mutindu bo vandaka kutala GPI-AP ya mbote ti kimvuka ya ceramide C26 na baproteine ​​yina vandaka kubasika na nzila ya ntu na nima ya kubasika na ER na S. Na kutala mutindu ya kukabula ER, beto sadilaka ngidika mosi ya genetique yina lenda mona mbala mosi bima ya mpa ya bo me vukisa ke kota na ERES na luzingu (7, 23). Mutindu bima ya kunata, beto ponaka GPI-AP Gas1 ya me simbama na ceramide C26 yina kele ti kidimbu ya proteine ​​ya mbwaki (GFP) mpi proteine ​​ya ke basikaka na nzila ya ntu (iRFP), yina yonso zole ke tadilaka ntu ya plasma (24–26). Na kati ya sec31-1 yina ke sobaka tiya, bima yai zole ke basikaka na nsi ya ntuadisi ya ke sadisaka na kubasisa galactose mpi ya kidimbu ya ERES yina ke salaka. Na tiya ya ngolo (37°C), sambu nsoba ya sec31-1 ke vandaka ti bupusi na kisalu ya kitini ya nsuki ya COPII Sec31 sambu na kukanga nzila na kuyela ya COPII mpi kubasisa ER na nganda, bima ya mpa ya bo me sala ke vukanaka na ER (23). Na nima ya kuyoka na tiya ya fioti (24°C), baselile ya sec31-1 yina ke sobaka me vutuka na kisika yina bo ke basisaka masa, mpi bo yantikaka kubasisa bima ya mpa yina bo me vukisaka na ER. Kutala na CLIM monisaka ti mingi ya ba Gas1-GFP mpe Mid2-iRFP yina ba me katuka kuvukisa me vukana kaka na ER ya ba cellule ya sec31-1 yina me baluka na manima ya kukangama na 37°C mpe na manima kubasika na 24°C na miniti 5 (Kifwanisu 1). Sambu Mid2-iRFP ke kabuanaka na zulu ya ER ya mvimba, mpe Gas1-GFP ke vukanaka mpe ke vukanaka na kizunga ya ER yina ke landanaka ve, kukabula na bau kele ya kuswaswana kibeni (Kifwanisu 1, A tii na C mpe Filme S1). Na zulu ya yau, mutindu kifwanisu 1D ke monisa yau, kimvuka ya Gaz1-GFP kele ve na Mid2-iRFP. Bamvutu yai kemonisa nde bo kabulaka GPI-AP mpi baproteine ​​yina ketambulaka na zulu ya ntu na bisika ya kuswaswana ya ntu ya ER na ntwala. Kibuka ya Gaz1-GFP kele pene-pene ya ERES mosi ya sikisiki yina bo me sonikaka na zulu ya mpusu ya nitu ya mCherry (Kifwanisu 1, E mpi F, mpi filme S1) (23).
Baselile ya sec31-1 ke basisaka bima yina ke basikaka na nzila ya galactose, nsinga ya nda ya acyl (C26) ya bo ke bingaka ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, vert) mpi proteine ​​yai ya ke sadisaka na kutambula na zulu ya nitu (TMP, bleu) mpi bo tulaka bidimbu yai ya ERES ya ke tungaka. miniti, bo me nata yo na 24°C, mpi bo me baka bifwanisu na SCLIM na nima ya miniti 5. (A tii na C) ke monisa kifwanisu ya 2D ya kuvukisa to mosi ya ke monisa avio (A), kifwanisu ya 2D ya ke monisa bitini 10 ya z (B) to kifwanisu ya 3D ya ndambu ya selile ya bima ya kutambula mpi ya bidimbu ya ERES (C). Barre ya nsuka 1μm (A na B). Kitini ya nene kele 0,551μm (C). Bau monaka Gaz1-GFP na bisika to na bimvuka ya ER ya kukabwana, na ntangu bau monaka Mid2-iRFP mpi bau kabulaka yau na kati ya nsinga ya ER (C). (D) Grafike ke monisa ngolo ya mvingu ya bantu na kati ya kimvuka ya mvingu ya bantu na nzila ya fleche ya mpembe (na diboko ya kimama). AU, unité ya luzolo. (E na F) ke monisa kifwanisu ya 3D yina ke vukisa bima na kidimbu ya ERES. Bau monaka ba kimvuka ya Gaz1-GFP pene-pene ya ERES ya sikisiki. Kitini ya nene kele 0,551μm. (F) Fleche ya mpembe ya ngolo ke monisa kimvuka ya Gaz1-GFP yina ke wakana ti ERES. Bapanneau ya kati-kati mpi ya diboko ya kitata ke monisa kifwanisu ya 3D yina bo me vukisa mpi mutindu bo me balula-balula kimvuka ya Gas1-GFP yina bo me pona.
Kuwakana ya pene-pene ya kisika na kati ya kimvuka ya Gaz1-GFP ti ERES mosi ya sikisiki ke monisa nde Gaz1-GFP lenda kota na ERES ya kupona, yina me swaswana ti kupona yina Mid2-iRFP ke sadilaka sambu na kubasika na ER. Samu na ku pesa mvutu na nzila yayi, beto me tala ntalu ya ERES samu na bima mosi to bima zole kaka (Kifwanisu 2, A na C). Beto me mona ti ba ERES mingi (70%) kele kaka na mutindu mosi ya bima. Kifwanisu ya nsi ya kifwanisu 2C ke monisa ba mbandu zole ya kifwani ya ERES yina kele na kaka Gaz1-GFP (kifwanisu 1) to kaka Mid2-iRFP (kifwanisu 2). Na kuswaswana, kitezo ya 20% ya ERES kele na ba bima zole yina ke kutana na kizunga mosi. Bau monaka ti ba ERES yankaka (10%) vuandaka na mitindu zole ya bima, kansi bau vuandaka na kisika mosi na bisika ya kuswaswana mbotembote. Na yina, lusalusu yayi ya ba ntalu ke monisa ti na manima ya ku tinda ER na nganda, GPI-AP Gaz1-GFP na charge ya transmembrane Mid2-iRFP ke kabuana na ba ERES ya kuswaswana (Kifwanisu 2D). Kusala mbote yai ya kupona ke wakana mingi ti bansosa ya biochimie yina bo salaka na ntwala (6) mpi kuzaba mutindu nitu ke vandaka (7). Beto lenda mpe kutala bifu ya bima ya kukangama yina ke kota na ERES (Kifwanisu 2E na Filme S2). Kifwanisu ya 2E ke monisa ti kaka kitini ya fioti ya Gaz1-GFP (panneau 3) to Mid2-iRFP (panneau 4) ke kotaka na ERES na ndambu mosi mpe ke kangamaka na kisika mosi ya kukabwana. Panel 5 ya kifwanisu 2E ke monisa ti Gas1-GFP na Mid2-iRFP ke monanaka ntangu yankaka na ERES mosi, kansi yau ke kotaka na ba ndambu ya kuswaswana mpe yau ke vukanaka na bisika ya kuswaswana yina lenda monisa ba nsinga ya COPII ya kuswaswana. Beto ndimisaka mpi nde kukabwana yina bo monaka mpi kutula na ndonga ya ERES ya kupona kele ya sikisiki sambu kizitu ya nkaka ya ke basikaka na nzila ya ntu, disongidila, proteine ​​ya ntu ya nitu yina kele ti kidimbu ya GFP (27 ), ke monisaka bikalulu ya mutindu mosi ti Mid2-iRFP. (Kifwanisu S1 mpi Filme S3). Ba nsangu ya mpa ya bo me vukisa ke kabuanaka na nzila ya ER bonso Mid2-iRFP (Kifwanisu S1, A na B), mpe ke vandaka kisika mosi na Mid2-iRFP na ba ERES mingi (Kifwanisu S1, B tii na D). Ba panneau 1 na 2 ya kifwanisu 1. S1C ke monisa ba mbandu zole ya kifwani ya ERES kisika ba charges zole ya transmembrane ke kutana. Na mambu yayi, bima nyonso zole ke kota na ERES kintuadi (Kifwanisu S1E, Panneau 3 na Filme S3).
Bau tulaka baselile ya sec31-1 yina ke basisaka bima yina ke basikaka na galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, vert) mpi Mid2-iRFP (TMP, bleu) mpi ba ERES yina ke salaka bima yina ke basisaka bima yina ke basikaka na nitu (ERES, magenta) na 37 Na nima ya kutula bima yina ke basikaka na nitu na nsungi ya minuta 30 °C. bloque, na kifwanisu na SCLIM na nima ya miniti 20. (A tii na C) Bifwanisu ya 2D ya ke monisa (A; barre d’échelle, 1μm) to bifwanisu ya 3D ya ndambu ya baselile (B na C; unité d’échelle, 0,456μm) ya bima ya kunata na bitini 10 ya z yina me tula kidimbu na ERES. Kusonga ya nsi na (B) mpi kitini ya (C) ke monisa bifwanisu yina bo me yidika sambu na kumonisa kaka bima yina kele na ERES (ya mbwaki-ble) [Gaz1-GFP (ya gris) mpi ya Mid2-iRFP (ya mbwaki-bleu)]. (C) Fleche ya kukangula: ERES ke nata kaka kitini mosi ya bima (1 tii na 4). Fleche ya gris: ERES kele ti bima ya kukabula (5). Fleche ya ngolo ya mpembe: ERES yina kele na bima ya kutula kisika mosi. Na nsi: ERES mosi ya bo me pona kele kaka ti Gaz1 (1) to Mid2 (2). Barre ya nene, 100 nm. (D) Kutanga ntalu ya foto yina bo me tubila na (C). Ntalu ya kati kati ya ba ERES yina kele na bima mosi kaka (Gaz1-GFP to Mid2-iRFP), bima ya kukabula na bima ya kukangama. Na kumeka tatu ya kimpwanza, n=432 na baselile 54. Barre ya kifu = SD. Teste ya t ya kukonda mikila zole. *** P = 0,0002. (E) Kifwanisu ya 3D ya ERES ya kuponama ya bima ya bo me tula na quarantaine yina bo me tula kidimbu (C). Gaz1-GFP (vert) (3) to Mid2-iRFP (bleu) (4) ke kotaka na ERES (magen) na ndambu mosi mpi ke vandaka kaka na kisika mosi ya fioti na kati ya ERES. Bantangu yankaka, mitindu yonso zole ya bima kekotaka na ERES mosi (5) na ndambu mosi mpi yo kekangamaka na kisika mosi ya ntama na kati ya ERES. Barre ya nene, 100 nm.
Na nima, beto mekaka ngindu mosi ya ke tuba nde ceramide ya nda ya nsinga ya acyl (C26) yina kele na kati ya ntunga ya ER ke pusaka kimvuka mpi kupona ya sikisiki ya Gas1 na ERES ya kupona. Na nsuka, beto sadilaka mutindu ya levire GhLag1 yina me soba, na kati ya yau ba ntuidi zole ya kati ya ntoto Lag1 mpe Lac1 me vutuka na kisika ya GhLag1 (homologue ya Lag1 ya coton), yina me basisa mutindu ya levire yina kele na ntuala ya selile yina kele nkufi na mutindu ya mfinda (Kifwanisu 3A) (2). Kufiongunina ya mvingu ya bantu (MS) monisaka ti na ba nsusu ya mutindu ya mfinda, 95% ya mvingu ya bantu nyonso kele mvingu ya bantu ya yinda mingi (C26), na ntangu yina na GhLag1, 85% ya mvingu ya bantu kele ya yinda mingi (C18 na C16). ), kaka 2% ya mvindu kele mvindu ya nsinga ya nda mingi (C26). Ata ba nsinga ya C18 ti ya C16 kele ba nsinga ya ntete ya bo me mona na kati ya nsinga ya GhLag1 tii bubu yai, bansosa ya MS me ndimisa mpi nde nsinga ya GPI ya Gas1-GFP yina bo ke monisaka na nsinga ya GhLag1 kele ti nsinga ya C26, yina lenda fwanana ti ba nsinga ya mafuta ya mutindu ya mfinda. Kikalulu kele mutindu mosi (Kifwanisu 3A) (26). Na yina, yau zola kuzonza ti enzyme ya kubongisa diaka bima ya mvingu ya bantu Cwh43 ke ponaka mingi bima ya mvingu ya bantu C26, mutindu ke monisama na kifwanisu 26, yau ke kotisaka mbote-mbote nsinga ya GPI katuka na mwa bima ya mvingu ya bantu C26 na kati ya mvingu ya bantu GhLag1. (29). Ata mpidina, na kisina, nsinga ya baselile ya GhLag1 kevandaka kaka ti nsinga ya C18-C16, kansi Gas1-GFP kevandaka kaka ti nsinga ya C26. Kieleka yai ke salaka nde kikalulu yai kuvanda kisadilu ya mbote sambu na kuyidika na siki-siki yonso diambu ya nda ya nsinga ya acyl ya ceramide ya membrane na ER. Mukumba ya hypothétique ya klase na ya kupona. Na nima, beto longukaka ntete makuki ya C26 Gaz1-GFP ya kuvukana na bimvuka na GhLag1 ti allele mosi ya ke sobaka yina ke wakana ti tiya na nzila ya mikroskopi ya ntama (Kifwanisu 3). Beto monaka nde na sec31-1, mingi ya Gaz1-GFP vandaka kuvukana na bimvuka, kansi Gaz1-GFP na sec31-1 GhLag1 ti nsinga ya ER ya nda (C18-C16) ya nda ya ceramide vandaka mingimingi ve na kimvuka mpi kukabula na Na kati ya nsinga ya ER ya mvimba. Na kutuba ya mbote, sambu kimvuka ya C26 yina kele na zulu ya ceramide kele na kuwakana ya ngolo ti ERES ya sikisiki (Kifwanisu 1), na nima beto sosaka kuzaba kana mutindu yai lenda tadila mpi kisalu ya mekanisme ya kubasisa proteine ​​ya ER. GPI-AP kesadilaka ngidika mosi ya sipesiali ya COPII sambu na kubasisa ER na nganda, yina ketwadisamaka na ngolo yonso na nzila ya kuyidika dyaka ya ngidika ya Ted1 ya kitini ya glycan ya nsinga ya GPI ( 30, 31 ). Na nima, bo ke zabaka GPI-glycan yina bo me vukisaka na nzila ya kimvuka ya p24 yina ke bakaka bima yina kele na kati ya nsinga ya nitu, yina na nima ke bakaka Lst1 na mutindu mosi ya kupona, yina kele isoforme mosi ya siki-siki ya kimvuka ya nene ya ke vukisaka bima ya COPII, yina ke salaka kimvuka mosi ya nene ya ke vukisaka bima ya COPII. Na yina, beto tungaka mvingu ya bantu zole yina vukisaka kukatula ya ba proteine ​​yayi mosi (kitini ya p24 ya mpasi Emp24, enzyme ya kuyidika diaka GPI-glycan Ted1 mpe kitini ya fioti ya COPII ya sikisiki Lst1) na mvingu ya bantu ya mvingu ya bantu, mpe beto longukaka bawu Keti mpila kele ya kusala mvingu ya bantu (Kifwanisu ya GFP1-c3). Beto monaka nde na sec31-1emp24Δ mpi na sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP kele mingi-mingi ya kukonda kimvuka mpi ya kukabwana na kati ya membrane ya ER, mutindu beto monaka yo ntete na sec31-1 GhLag1, kansi na sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Bonso sec3. Ba mvutu yayi ke monisa ti, na nganda ya kuvanda ya ceramide C26 na kati ya ER, kimvuka ya Gas1-GFP kele mpe na mfunu ya kukangama na kimvuka ya p24, mpe yau ke lomba ve kubaka Lst1 ya sikisiki. Na nima, beto sosaka kuzaba kana nda ya nsinga ya ceramide yina kele na kati ya nsinga ya ER lenda yidika mutindu Gas1-GFP ke vukanaka ti p24. Kasi, beto me mona ti kuvanda ya ceramide C18-C16 na kati ya mvingu ya bantu ke sala ve ata kima mosi na ba glycans ya GPI yina me tungama diaka na nzila ya kimvuka ya p24 (Bifwanisu S3 mpe S4, A mpe B) to kukangama na GPI-AP mpe kubasisa GPI-AP na nganda. makuki. Kubaka bantu na kisalu ya COPII ya mutindu ya fioti Lst1 (Kifwanisu S4C). Na yina, kimvuka ya C26 yina ke tadila ceramide ke lombaka ve kusalasana ya ba proteine ​​ti mitindu ya kuswaswana ya kubasisa ba proteine ​​ya ER, kansi yo ke sadisaka mutindu ya nkaka ya kupona yina ke pusamaka na nda ya mafuta. Na nima, beto tadilaka kana nda ya nsinga ya acyl ya ceramide na kati ya nsinga ya ER kele mfunu sambu na kutula mbote-mbote Gas1-GFP na ndonga ya ERES ya kupona. Sambu Gaz1 na kati ya kimvuka ya GhLag1 yina kele ti nsinga ya nkufi ke basikaka na ER mpi ke kotaka na kati ya nsinga ya plasma (Kifwanisu S5), beto ke kwikilaka nde kana kuponama ke pusamaka na nda ya nsinga ya acyl ya ceramide, Gaz1 na kati ya kimvuka ya GhLag1 lenda vutukila nzila mpi kusabuka. Bima ya ERES ti nsinga ya mutindu mosi.
(A) Nsinga ya baselile ya GhLag1 kele mingimingi ti ba ceramide C18-C16 ya nkufi, kansi nsinga ya GPI ya Gas1-GFP kele kaka ti IPC C26 ya mutindu mosi ti baselile ya mutindu ya mfinda. Na zulu: kufimpa nda ya nsinga ya acyl ya ceramide na kati ya nsinga ya baselile ya mitindu ya mfinda (Wt) mpi ya GhLag1p na nzila ya spectrométrie ya masse (MS). Ba nsangu ke monisa ntalu ya mvimba ya ba ceramide. Mwayene ya ba eksperiansi tatu ya kimpwanza. Barre ya kifu = SD. Teste ya t ya kukonda mikila zole. **** P <0,0001. Na nsi ya ntoto: Kufiongunina ya MS ya nda ya nsinga ya acyl ya IPC yina kele na nsinga ya GPI ya Gas1-GFP (GPI-IPC) yina bo ke monisaka na mitindu ya mfinda mpi na ba nsinga ya GhLag1p. Ba nsangu ke monisa ntalu ya mvimba ya bidimbu ya IPC. Mwayene ya ba eksperiansi tanu ya kimpwanza. Barre ya kifu = SD. Teste ya t ya kukonda mikila zole. ns, mfunu ve. P = 0,9134. (B) Bafoto ya fioti ya ke monisa nsemo ya baselile yina ke monisaka Gaz1-GFP yina bo me basisa na nsadisa ya galactose, bo tulaka yo na zulu ya 37°C sambu na minuta 30. na nima ya 24°C. Fleche ya mpembe: Kimvuka ya ER Gaz1-GFP. Fleche ya kukangula: Gas1-GFP ya kukonda kimvuka me kabuana na zulu ya ER ya mvimba, yo ke monisa kikalulu ya ER ya ke vandaka ti mukubu ya bague nucléaire. Barre ya nene, 5μm. (C) Kutanga ntalu ya foto yina bo me tubila na (B). Ntalu ya mwayene ya baselile yina kele ti ngidika ya Gas1-GFP ya kele ti bidimbu. Na kumeka tatu ya kimpwanza, n≥300 ya baselile. Barre ya kifu = SD. Teste ya t ya kukonda mikila zole. **** P <0,0001.
Na nima ya kumanisa mbala mosi diambu yai, beto salaka kifwanisu ya SCLIM ya Gas1-GFP mpi ya Mid2-iRFP na GhLag1 ti allele ya ke balukaka yina ke wakana ti tiya (Kifwanisu 4 mpi Filme S4). Na nima ya kubumba ER na 37°C mpi na nima kubasisa yo na 24°C, mingi ya Gas1-GFP yina bo me katuka kusala vandaka kuvukana ve mpi kukabwana na zulu ya ER yonso, mutindu bo ke monaka yo na bamikroskope ya ntama (Kifwanisu 4, A mpi B ). Na ku yika, ntalu ya nene ya ERES (67%) kele na mitindu zole ya bima ya kunata yina kele na kisika mosi na kati na yau (Kifwanisu 4D). Ba panneau 1 na 2 ya kifwanisu 4C ke monisa ba mbandu zole ya kifwani ya ERES na Gaz1-GFP na Mid2-GFP yina ke landanaka. Na zulu ya yau, bima nyonso zole bakamaka na kati ya ERES mosi (Kifwanisu 4E, panneau 3 na filme S4). Na yau, bamvutu na beto kemonisa nde nda ya nsinga ya acyl ya ceramide na kati ya nsinga ya ER kele kima mosi ya mfunu ya kesadisaka na kuzaba mutindu ya kuvukisa mpi ya kukabula baproteine ​​ya ER.
Baselile ya GhLag1 yina ke basisaka masa yina ke basikaka na galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, vert) mpi Mid2-iRFP (TMP, bleu) mpi Sec13-mCherry yina kele ti kidimbu ya ERES (ERES, mbwaki-bleu) yina ke salaka bima yina ke basikaka na nitu (ERES, magenta) Kukangama na 37°C. Landa kusala na miniti 30, kulumusa na 24°C sambu na kubasisa masa ya ke basika na nitu, mpi sala kifwanisu ti SCLIM na nima ya miniti 20. (A tii na C) Bifwanisu ya 2D ya ke monisa (A; barre d’échelle, 1μm) to bifwanisu ya 3D ya ndambu ya baselile (B na C; unité d’échelle, 0,45μm) ya bitini 10 ya z yina me tula kidimbu na bima ya kunata na ERES. Kusonga ya nsi na (B) mpi kitini ya (C) ke monisa bifwanisu yina bo me yidika sambu na kumonisa kaka bima yina kele na ERES (ya mbwaki-ble) [Gaz1-GFP (ya gris) mpi ya Mid2-iRFP (ya mbwaki-bleu)]. (C) Fleche ya kufuluka ya mpembe: ERES, bima ke kutana. Fleche ya kukangula: ERES kele kaka ti kima mosi. Panel ya nsi: ERES yina me ponama kele na bima ya kukangama (1 na 2) yina me tula kidimbu na (C). Barre ya nene, 100 nm. (D) Kutanga ntalu ya foto yina bo me tubila na (C). Na kati ya ba unités ya GhLag1, kaka bima mosi (Gaz1-GFP to Mid2-iRFP) ke kota, mpe ntalu ya kati kati ya ba ERES samu na bima ya kukabwana mpe bima ya kukangama. Na kumeka tatu ya kimpwanza, n = 432 na kati ya baselile 54 (kitini 31-1) mpi n = 430 na kati ya baselile 47 (kitini 31-1 GhLag1). Barre ya kifu = SD. Teste ya t ya kukonda mikila zole. *** P = 0,0002 (kitini 31-1) mpe ** P = 0,0031 (kitini 31-1). (E) Kifwanisu ya 3D ya ERES ya kuponama ti bima ya kukangama (3) yina bo me tula kidimbu na (C). Gaz1-GFP (vert) mpe Mid2-iRFP (bleu) ke pusana na ERES (magen) na ndambu mosi mpe ke bikala na kisika mosi yina ERES me kangama. Barre ya nene, 100 nm.
Kulonguka yayi ke pesa nzikisa ya mbala mosi na in vivo ti ba cargo ya ba proteine ​​yina kele na mafuta ke kabuanaka na bisika ya kupona na nzila ya kubasisa menga, mpe ke monisa mfunu ya nda ya nsinga ya acyl samu na kupona ya kutula na ndonga. Na nsadisa ya mayele mosi ya ngolo mpi ya mpa ya bo ke bingaka SCLIM, beto monisaka Gas1-GFP yina bo me katuka kusala (GPI-AP ya nene ya kele ti kitini ya mafuta ya ceramide ya kele ti nsinga ya acyl (C26) ya nda kibeni) na kati ya levire ) Bisika yina bo me vukisa na baproteine ​​ya kinsweki ya bo me kabulaka na nzila ya ES, . nsinga ya ER (Kifwanisu 1). Na zulu ya yau, mitindu zole ya bima yayi ke kotaka na ba ERES ya kuswaswana na mutindu ya kupona (Kifwanisu ya 2). Nda ya nsinga ya acyl ya ceramide ya selile na kati ya ntunga ke kulumuka katuka na C26 tii na C18-C16, kimvuka ya Gaz1-GFP ke panzana na kisika ya ER ya kukabwana, mpi Gaz1-GFP ke baluka na nzila sambu na kukatuka na ER ti proteine ​​ya ke lutaka na kati ya ntunga na nzila ya ERES yina mosi (Kifwanisu 3 mpi Kifwanisu 3). 4).
Ata GPI-AP kesadilaka mutindu mosi ya proteine ​​ya kuzaba sambu na kubasika na ER, beto monaka nde kukabwana ya C26 yina kesimbamaka na ceramide ketulaka ve ntima na bangwizani ya kuswaswana ya proteine ​​yina lenda nata na kuzaba ERES (Bifwanisu S4 mpi S5). Na kisika na yau, mambu ya beto me mona ke pesa maboko na mutindu ya nkaka ya kukabula bima yina ke pusamaka na kimvuka ya ba proteine ​​yina kele na mafuta mpi na nima kukatula bima ya nkaka. Ba nsangu na beto ke monisa nde kisika to kimvuka ya Gas1-GFP yina ke vukanaka ti ERES mosi ya siki-siki ke vandaka ve ti proteine ​​yina ke basikaka na nzila ya mpusu ya nitu ( 2). Na kuswaswana, kuvanda ya ba ceramide C18-C16 na kati ya ER ke sala ve nde GPI-AP kusala bisika to bimvuka, yo yina yo ke katulaka ve to ke yingisaka ve ba proteine ​​yina ke basikaka na nzila ya ERES yina mosi (Bifwanisu 3 mpi 4). . Na yina, beto ke pesa ngindu ti ceramide C26 ke nata kukabula mpe kutula na ndonga na kusadisaka na kuvukisa ba proteine ​​yina kele na nguizani na ba ERES ya sikisiki.
Inki mutindu kulungisa kimvuka yai ya ke tadila ceramide ya C26 na kisika mosi ya siki-siki ya ER? Kikalulu ya kukabwana na balweka lenda sala nde GPI-AP ti C26 kusala mafuta ya fyoti mpi ya bo metulaka na ndonga na mbala mosi na kisika ya mafuta ya kukonda kulandana ya ER yina kele ti mafuta ya nkufi mpi ya kukonda kufuluka. Bimvuka ya bikalulu (17, 18). Bimvuka yai ya fyoti ya ntangu fyoti lenda vukana dyaka na bimvuka ya nene mpi ya kukonda kusoba na nima ya kukangama na kimvuka ya p24 (34). Na kuwakana ti mambu yai, beto monisaka nde C26 Gas1-GFP kele na mfunu ya kuvukana ti kimvuka ya p24 sambu na kusala bimvuka ya nene ya ke monanaka (Kifwanisu 3). Kuvukisa ya p24 kele oligomère hétérozygote yina mesalamaka na baproteine ​​iya ya kuswaswana ya p24 yina kele na kati ya levire (35), yina kepesaka nzila ya kukangama ya bima mingi, yina lenda nata na kukangama ya bimvuka ya fyoti ya GPI-AP, ebuna yo kebutaka kimvuka ya nene ya Stable (34). Kusalasana na kati ya ba ectodomaine ya ba proteine ​​ya ba GPI-AP lenda mpe kusadisa na kuvukisa bau, mutindu yau ke monisama na ntangu ya kutambula na bau ya Golgi na ba cellule ya epitelium ya ba mammifères ( 36 ). Kansi, kana ceramide C18-C16 kele na kati ya ER, kana kimvuka ya p24 kekangama na Gas1-GFP, bimvuka ya nene ya kukabwana tasalama ve. Mutindu ya kusala mambu lenda tadila bikalulu ya sikisiki ya fiziki mpi ya kimunganga ya ceramide ya chaîne d’acyle ya nda. Ba ndongokolo ya biofiziki ya ba nsinga ya bantu me sala ke monisa ti ata ba nsinga ya nsinga ya nda (C24) mpe ya nkufi (C18-C16) lenda sala ti ba fase kukabwana, kaka ba nsinga ya nsinga ya nda (C24) lenda sadisa na kupesa nzila na Courbure ya ngolo mpe kukangama ya filme samu na kuyidika diaka mutindu ya filme. Na nzila ya kulandana (17, 37, 38). Yau memonisama nde hélice ya TMED2, yina kele kifwani ya Emp24 ya muntu, kesalaka na mutindu mosi ya kupona ti sfingomyéline yina kele na zulu ya ceramide C18 na kati ya bima ya kesimbaka nitu ( 39 ). Na kusadilaka ba nsangu ya mvingu ya bantu (MD), beto monaka ti ba ceramide C18 mpe C26 nyonso zole ke vukanaka na nziunga ya ba nzungu ya mvingu ya bantu ya Emp24, mpe ba ke zolaka mambu ya mutindu mosi (Kifwanisu S6). Yau kele mfunu na kuzaba nde yau kemonisa nde hélice ya Emp24 yina kele na kati ya nsinga lenda nata na kukabula ya kukonda kuwakana ya mafuta na kati ya nsinga. Yai kele mvutu ya ntama mingi ve ya me katuka na baselile ya bambisi yina ke sansaka bana. Ba simulation ya mutindu mosi ya MD ke monisa mpi kuvanda ya mafuta ya éther (40) . Na yina, beto ke banza ti C26 yina kele na ba lobule zole ya ER26 ke vuanda na kimvwama ya kisika mosi. Kana GPI-AP na kati ya bambuma ya lumière kekangamaka mbala mosi na p24 ya kele ti bima mingi mpi kevukisaka ceramide ya C26 na nziunga ya p24 na kati ya bambuma ya lumière, yo lenda sadisa na kuvukisa baproteine ​​yina kekwendaka nzila mosi ti yo mpi kukangama ya membrane kebasikaka na nzila ya misapi ( 41 ), ebuna yo kesalaka nde GPI-AP kukabwana mpi na bisika ya zulu yina kevandaka ti bima mingi ya kukangama. bisika ya ER (42). Ba rapore ya ntete pesaka maboko na mutindu yina bo vandaka kuyindula (43, 44). Kukangama ya mitindu mingi ya ba oligolectine, ba maladi to ba anticorps na ba glycosphingolipides (GSL) yina kele na zulu ya ntu ya plasma ke basisaka kimvuka ya nene ya GSL, ke kumisaka ngolo kukabwana ya ba fase mpi ke salaka nde ntu kubeba mpi kukota na kati ( 44 ). Iwabuchi etc.
Na kati ya baselile ya ntu ya bambisi yina ke nwisaka bana, kimvuka ya réseau anti-Golgi (TGN) na nivo ya ntu ya ntu ke twadisaka kukabwana mpi kupona ya GPI-AP ( 10, 45 ). Kuvukisa yai ke salamaka na nzila ya oligomérisation ya GPI-AP (36), kansi yo lenda tadila mpi nda ya nsinga ya ceramide yina beto ke monaka na levire. Ata GPI-AP ya bambisi yina ke nwisaka bana kele ti nsinga ya ke simbaka mafuta ya éther, mpi mutindu na yo ya kimunganga me swaswana kibeni ti ceramide ya chaîne d’acyle ya nda kibeni, kulonguka mosi ya me katuka kusalama monisaka nde mafuta yonso zole kele ti bikalulu mpi kisalu ya mutindu mosi na yina me tala evolisio (40). Na yau, kitini ya mafuta ya éther na baselile ya bambisi ya mabele lenda vanda mutindu mosi ti ceramide C26 yina kele na levire, mpi kisalu na yau kele ya kuvukana ti ceramide ya nsinga ya nda na kati ya nsinga ya ntu sambu na kusadisa GPI-AP na kuvukisa mpi na kupona. Ata mpila yai kele kaka na mfunu ya kumeka mbala mosi, mambu yina bo me monaka na ntwala ke ndimisa nde kunata ceramide ya chaîne d’acyle ya nda na nitu ya Golgi ke salamaka ve na nzila ya baproteine ​​yina ke nataka bima na nitu, kansi yo ke tadila mutindu bo ke vukisaka bima yina ke simbaka GPI bonso levire. 13:16, 20, 46, 47) ke monana nde yo lenda nata na mutindu mosi ya kupona-pona bima yina ke vandaka ti nsinga ya nda kibeni mpi GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) na kati ya vesicule mosi ya ke nataka bima.
Na kati ya baselile ya levire mpi ya bambisi yina ke sansaka bana, kuvukisa GPI-AP mpi kukabwana ti baproteine ​​ya nkaka ya plasma ke salamaka na ntwala nde yo kuma na zulu ya baselile. Paladi mpi bankaka. ( 48 ) monaka nde na TGN ya baselile ya epiteliale ya bambisi yina ke nwisaka bana, kuvukisa GPI-AP kele mfunu kaka ve sambu na kutula na ndonga ya kupona ya GPI-AP na zulu ya ntu, kansi yo ke twadisaka mpi mutindu ya kuvukisa baselile ya GPI-AP mpi kisalu na yo ya biolozi. Lupangu ya selile. Na nsadisa ya levire, kulonguka yai monisaka nde kimvuka ya GPI-AP yina ke tadila ceramide C26 na zulu ya ER lenda yidika mutindu ya kuyidika kimvuka mpi kisalu ya GPI-AP yina kele na zulu ya mpusu ya menga ( 24 , 49 ). Na kuwakana ti mbandu yai, baselile ya GhLag1 ke vandaka ti maladi ya ngolo na bima yina ke kangaka GPI to na bankisi yina ke bebisaka bumosi ya bibaka ya baselile (28), mpi mfunu ya bimvuka ya Gas1-GFP yina ke salaka (49) ya ceramide ya nsuka yina bo ke monisaka na kuvukisa baselile ya levire ke monisa G Bampasi yina lenda basika na nitu ya baselile ya hLag1. Kifu ya GPI-AP. Kansi, kumeka dyaka kana bo metulaka programe ya ngidika ya kisalu ya zulu ya baselile katuka na ER na nzila ya metode ya kupona yina mesimbama na nda ya mafuta ya nitu tavanda ntu-dyambu ya bansosa na beto ya bilumbu kekwisa.
Ba nsinga ya nseke yina ba me sadila na kisalu yayi me sonikama na Tableau S1. 1583 mpe MMY1635 ya SCLIM samu na kukanga bifwanisu ya baselile ya luzingu, ba tungaka yau na nsuka ya W303. Ba nsinga yai ya ke monisaka Sec13-mCherry yina kele ti kidimbu ya proteine ​​ya ke sema, bo tungaka yo na kusadilaka metode mosi ya me simbama na nzila ya réaction en chaîne de polymérase (PCR) ti plasmide pFA6a bonso mbandu (23). Bau tungaka mutindu yai, kimvuka yina kemonisaka Mid2-iRFP yina bo metulaka kidimbu ti proteine ​​yina kepelaka na nsi ya kiyeka ya muntu yina kesadisaka GAL1. Kuyedisa ya PCR ya ndonga ya iRFP-KanMx katuka na vecteur ya pKTiRFP-KAN (dikabu ya E. O’Shea, nimero ya plasmide ya addgene 64687; Na nima ya kuyedisa ndonga ya ba gènes ya Mid2-iRFP mpi ya kuvukisa yo na kati ya nsadisa ya GAL1, bo kotisaka yo na kisika ya I-Sac I ve ya plasmide pRS306 ya kuvukisa. Bau tulaka ba plasmide pRGS7 yina basikaka na ndonga ti Pst I sambu na kukota na kati ya kisika ya URA3.
Bau kemonisaka gène ya kuvukisa Gas1 ti GFP na nsi ya kiyeka ya muntu yina kesadisaka GAL1 na kati ya plasmide ya centromère (CEN), yina bo ketungaka mutindu yai. (dikabu ya L. Popolo) mpi bo salaka yo na kisika ya Xma I–Xho I ya plasmide ya CEN (dikabu ya C) . Mulangi; Nimero ya plasmide ya 51225; 51225; RRID: Kuyidika_51225). Bo pesaka plasmide yina basikaka zina ya pRGS6. Bau ke monisaka mpi gène ya ke vukisaka Axl2 ti GFP na nsi ya kiyeka ya muntu yina ke sadisaka GAL1 na vecteur LEU2 ya pBEVY-GL, mpi mutindu bo ke tungaka yo kele mutindu yai. Bau me kumisa kulandana ya Axl2-GFP ngolo na nzila ya PCR, mpe bau me sala yau na kisika ya Bam HI-Pst I ya vecteur LEU2 ya pBEVY-GL. Bo pesaka plasmide yina basikaka zina ya pRGS12. Ndonga ya ba nsinga ya kusadila na kulonguka yayi kele na ndonga ya S2.
Bau yikaka na kati ya 0,2% ya adenine mpe 2% ya sukadi [YP-dextrose (YPD)], 2% ya raffinose [YP-raffinose] ya mvingu ya bantu yina ke katukaka na levire p (YP) ya kati-kati (1 % ya mvingu ya bantu mpe 2% ya mvingu ya bantu). (YPR)] to 2% ya galactose [YP-galactose (YPG)] bonso kisina ya carbone, to na kati ya nkisi mosi ya fioti ya bo me sala (0,15% ya levire ya azote mpi 0,5% ya sulfate d’amonium) sambu na kuyika ba acide aminé mpi ba base ya me fwana yina ke lombamaka sambu na madia , Mpi yina kele ti 2% ya sukadi to ya sukadi ya fioti ( (galaktose ya bo me sala na mutindu ya fioti) bonso kisina ya carbone.
Sambu na kubaka bifwanisu na ntangu ya kyeleka, baselile ya sec31-1 yina kesobaka tiya yina kemonisaka mutindu ya kutunga na nsi ya ntuadisi ya GAL1, bo yelaka na kati ya ntoto ya YPR na 24°C na mpimpa mosi tii na kati-kati ya fase ya log. Na nima ya kukota na YPG na 24°C na nsungi ya ngunga 1, bo tulaka baselile na SG na 37°C na nsungi ya miniti 30, mpi na nima bo nataka yo na 24°C sambu na kubasika na bloque ya kubasisa masa. Bau sadilaka concavaline A samu na kukanga baselile na zulu ya diapozitive ya ditensi mpe bau salaka bifwanisu na SCLIM. SCLIM kele kimvuka ya mikroskope ya Olympus IX-71 ya ke balukaka na zulu ya nsemo mpi ya UPlanSApo (Olympus), ya vitesi ya ngolo mpi ya ngolo ya ke monisaka makelele (Yokogawa Electric) mpi ya bo me yidika mbote-mbote. ( Fotoniki ya Hamamatsu ) lenda pesa ngidika ya bima yina ke kumisaka bima nene ti ngolo ya nsuka ya ×266,7 mpi kamera mosi ya kele ti charge yina ke kumisaka ba électron mingi ( Fotonike ya Hamamatsu ) (21). Kubaka bifwanisu ke salamaka na nzila ya logiciel ya bo me yidika (Kura ya Yokogawa). Sambu na bifwanisu ya 3D, beto sadilaka kima mosi ya bo me salaka na mutindu mosi buna sambu na kunikisa lense ya objectif na mutindu ya kutelama, mpi beto vukisaka bitini ya optique na kitamina ya 100 nm na kimvuka mosi. Bau ke balulaka kifwanisu ya Z-stack na bansangu ya ba voxel 3D, mpe kisalu ya kupanzana ya bapoint ya théorie yina ba ke sadilaka samu na mikroskope ya disque confocale yina ke balukaka ke sadilamaka samu na kusala kisalu ya kukatula ba nsangu na nzila ya logiciel Volocity (PerkinElmer). Na kusadilaka logiciel Volocity samu na kukangama na mbala mosi samu na kufiongunina kisika mosi, ERES na kati ya yau bima ya kunata me tesama. Bau salaka bansosa ya nzila na nsadisa ya logiciel MetaMorph (Ba apareyi ya Bamolekile).
Sadila logiciel GraphPad sambu na kuzaba mfunu ya bansangu. Samu na t-test ya balongoki ya mikila zole mpe test ya mpamba ya kufiongunina ya nzila mosi (ANOVA), luswaswanu na kati ya bimvuka ke tadisamaka na kuvanda na bupusi ya nene na P <0,05 (*).
Samu na kutala na nzila ya mvingu ya bantu, ba cellules ya fase ya log me kula na mpimpa mosi na YPD mpe ba me vukisa yau na nzila ya mvingu ya bantu, bau me sukula yau mbala zole na masa ya mungwa yina kele na tampon ya fosfate, mpe bau me tula yau na zulu ya glace na kitezo ya miniti 15, mpe na manima bau me sala yau na nsi ya mvingu ya bantu mutindu bau me tubila yau na zulu (Check24). Bau sadilaka mikroskope ya Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1,40 huile PH3 CS) yina kele na kima ya kutala, filtre L5 (GFP), kamera ya Hamamatsu mpe logiciel ya Application Suite X (LAS X) samu na kuzwa yau. .
Bau salaka ba échantillons na tampon ya ba échantillons ya SDS na 65°C na nsungi ya miniti 10, na nima bau kabulaka yau na nsadisa ya électrophorèse na gel ya SDS (LUTITI). Samu na kufiongunina ba nsangu ya mvingu ya bantu, ba tulaka 10 μl ya échantillon na nzila mosi mosi. Nkisi ya ntete: Sadila nkisi ya lapin yina ke fwaka Gaz1 na kiteso ya 1:3000, nkisi ya ke fwaka Emp24 ya lapin na kiteso ya 1:500, mpi nkisi ya ke fwaka GFP (dikabu ya H. Riezman) na kiteso ya 1:300. Bau sadilaka mvingu ya bantu yina ke nwanisaka Pgk1 na 1:5000 (dikabu ya J. Nkisi ya zole ya ke taninaka nitu: IgG (IgG) ya nkombo yina ke nwanaka ti lapin (HRP) yina bo ke sadilaka na kiteso ya 1:3000 (Pierce). Bau sadilaka IgG ya nkombo yina me vukana na HRP na nsadisa ya masa ya 1:3000 (Pierce). Bau monaka kisika yina nitu ke pesaka mvutu na nsadisa ya metode ya kimunganga ya bo ke bingaka réactif ya Pico ya Westi (Thermo Fisher Scientific).
Mutindu bo me tubila yo na (31), bo salaka eksperiansi mosi ya ke sadisaka nitu na kukangama ngolo na kitini ya ER yina bo me kumisaka mvwama. Na bunkufi, yobisa baselile ya levire ti tampon ya TNE [50 mM ya tris-HCl (pH 7,5), 150 mM ya NaCl, 5 mM ya EDTA, 1 mM ya fluorure de phenylméthylfonyl mpi ya kuvukisa ya bima yina ke kangaka protease) na 600 nm ( OD600) na mbala 100. Bo vandaka kupasula yo ti bima ya ditensi, mpi na nima bo vandaka kukatula bima ya baselile mpi bima ya ditensi na nzila ya centrifugation. Na nima, bo vandaka kutula masa yina vandaka na zulu na yo na 17 000 g na nsungi ya miniti 15 na 4°C. Bau ke vutulaka mbuma na TNE mpe bau ke yikaka saponine ya digitalis na kitezo ya nsuka ya 1%. Bau ke tulaka bima yina na kati ya ntoto na ngunga 1 na kubaluka na 4°C, na nima bau ke katulaka bima yina ke lembaka ve na nzila ya centrifugation na 13 000 g na 4°C na nsungi ya miniti 60. Samu na ku pesa nzila na mvingu ya bantu, ntete tula na ntwala mvingu ya bantu na ba mbuma ya agarose ya mpamba (ChromoTek) na 4°C na ntangu mosi, mpe na manima tula mvingu ya bantu na 4°C na ntangu 3. Bau sukulaka ba mbuma yina me fuluka na nitu mbala tanu na TNE yina kele na 0,2% ya digoxigénine, bau katulaka yau na tampon ya échantillon ya SDS, bau kabulaka yau na SDS-PAGE, mpe bau fimpaka yau na nsadisa ya mvingu ya bantu.
Mutindu bo me tubila yo na (31), bo salaka bansosa ya ke tadila kuvukisa bima na kitini ya ER yina bo me kumisaka mvwama. Na bunkufi, bo tulaka kitini ya ER yina bo me kumisa ngolo ti dithiobis (propionate de succinimidyl) 0,5 mM ( Bau fwaka mvingu ya bantu na kuyikaka glycine (50 mM ya nsuka, miniti 5, 20°C).
Mutindu beto tubilaka yo na zulu (50), bo salaka bansosa ya MS ya ceramide na ba nsinga ya nseke mpi ya GhLag1. Na bunkufi, bo kumisaka baselile nene tii na kisika ya kukula (3 tii na 4 OD600 unités/ml) na YPD na 30°C, mpi bo katulaka baselile 25×107. Bo ke fwaka bima yina ke sadisaka nitu na bo na nzila ya aside trichloracétique. Sadila bima ya kukatula [éthanol, masa, éther, piridine mpe 4,2 N ya hydroxyde d’amonium (15:15:5:1:0,018 v/v)] mpe 1,2 nmol ya ceramide C17 ya kati (860517, lipide polaire Avanti) ya kitoko). Sadila réactif monométhylamine [méthanol, masa, n-butanol mpe solution ya méthylamine (4:3:1:5 v/v)] samu na kusala hydrolyse alcaline ya petepete ya bima yina ba me katula, mpe na manima sadila n-butanol ya kufuluka na masa samu na kukatula mungwa. Na nsuka, bo tulaka diaka bima yina bo katulaka na kati ya ntunga ya mbote [chloroforme/méthanol/masa (2:7:1) + 5 mM ya acétate d’amonium] mpi bo tulaka yo na kati ya ntunga ya masa. Bau salaka kisalu ya kutala mambu mingi (MRM) samu na kuzaba mpe kuzaba ntalu ya ba nsinga ya sfingolipide. TSQ Vantage ( Thermo Fisher Scientific ) kele ti kima mosi ya bo ke bingaka Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) yina ke basisaka ba ion ya fioti-fioti sambu na kutadila mafuta ya nitu. Energie ya kubula ke vandaka ya kuyidika mbote sambu na konso ndonga ya ceramide. Ba nsangu ya MS bakamaka na mutindu ya mbote. Sambu na konso mvutu ya biolozi, kidimbu ya mafuta kele kati-kati ya bitesilu tatu ya kimpwanza.
Mutindu bo me tubila yo na (31), bo tulaka baselile (800×107) yina ke basisaka Gaz1-GFP na nsadisa ya bima yina ke taninaka nitu na nitu. Bau kabulaka Gaz1-GFP yina bau mesukulaka na nzila ya SDS-PAGE mpi bau tulaka yau na kati ya nsinga ya bo mesala ti fluorure de polyvinylidène (PVDF). Bau vandaka kumona proteine ​​yina na kutula mukubu na PVDF ti amide ya ndombe. Bau zengaka bande ya Gaz1-GFP na PVDF mpe bau sukulaka yau mbala 5 na metanol mpe mbala mosi na masa ya grade ya MS (LC-MS). Na nsadisa ya 500 μl ya NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampon mpi 500 μl ya nitrite ya sodium 1 M yina bo me katuka kuyoka na 37°C na nsungi ya bangunga 3, kitini ya mafuta ke basikaka na Gaz1-GFP mpi na kati ya glucose ya bo me vukisaka. (51). Na nima, bo yobisaka bande ya membrane mbala iya ti masa ya kele ti grade LC-MS, bo yumisaka yo na tiya ya nzo, mpi bo bumbaka yo na mupepe ya azote na -80°C tii kuna bo ta sala bansosa. Na mutindu ya kutala, bau sadilaka mbandu ya mpembe ya membrane ya PVDF samu na konso kumeka. Na nima, bo tadilaka mafuta yina bo katulaka na Gaz1-GFP na nzila ya MS mutindu bo tendulaka yo (50). Na bunkufi, ba nsinga ya PVDF yina kele na mafuta ya GPI, bo tulaka yo diaka na zulu ya 75μl ya masa ya ke katulaka mvindu ya mbi [chloroforme/méthanol (1:2) + 5 mM d’acétate d’ammonium] mpi bo lutisaka yo na nsadisa ya ionisation électrospray (ESI)-Analyse MRM/MS des espèces d’esphingolipides (TSQ Vantage). Na ntangu yina, bo bakaka bansangu ya MS na mutindu ya ion ya mbi.
Mutindu beto tubilaka yo na zulu, bo katulaka kitini ya mafuta ya nsinga ya GPI ti GPI-AP yina bo me sonikaka na [3H] (16). Bau kabulaka mafuta na nzila ya chromatographie ya fioti-fioti na kusadilaka ngidika ya kuyoka (55:45:10 chloroforme-méthanol-0,25% KCl) mpe bau monaka yau na meso na kusadilaka FLA-7000 (Fujifilm).
Bau sukulaka baselile yina ke basisaka Gaz1-GFP (600×107) mbala zole ti tampon ya TNE ti tampon ya TNE, mpi bo bukaka yo ti bima ya ditensi, mpi na nima bo tulaka yo na kati sambu na kukatula bima ya baselile mpi bima ya ditensi. Na nima, bo vandaka kutula masa yina vandaka na zulu na yo na 17 000 g na nsungi ya ngunga 1 na 4°C. Bau ke sukulaka mbuma na TNE mpe bau ke tulaka yau na kati ya TNE yina kele na 0,2% ya saponine ya digitalis na ngunga 1 na 37°C. Na nima ya kusadila enzyme, bo katulaka nsinga yina na nzila ya kuyoka yo na 17 000 g na 4°C na nsungi ya ngunga 1. Sambu na kukanga Gaz1-GFP, bo tulaka masa yina vandaka na zulu ya masa yina na zulu ya nitu na 4°C na mpimpa ya mvimba. Bau tulaka mukubu ya bleu ya ngolo ya Coomassie yina bo me katulaka na nzila ya SDS. Bau zengaka bande ya kutula mukubu ya Gas1-GFP na gris yina vandaka na nziunga ya nzila ya masa, mpi na nima ya kuyoka yo ti yodoacétamide mpi ya kukulumusa yo ti dithiothréitol, bo salaka digestion na kati ya gel ti trypsine. Kukatula na kuyumisa ba mbuma ya tryptique na ba mbuma ya GPI-glycans. Bau ke tulaka ba peptide ya kuyuma na 20 μl ya masa. Tula kitini ya (8μl) na kati ya LC. 150 mm×1,0 mm; Nomura Chemical, na provense ya Aichi, na Japon) sambu na kukabula ba peptide na nsi ya mambu ya sikisiki ya ke tambulaka na zulu. Fase ya kutambula kele nkisi A (0,08% ya aside formique) mpe nkisi B (0,15% ya aside formique na 80% ya aside formique). Bau sadilaka ngidika mosi ya HPLC ya Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) sambu na kukatula masa na kati ya nsinga ya masa A na nsungi ya miniti 55 na vitesi ya 50 μl min-1 na nsungi ya miniti 5, na nima bau matisaka ntalu ya masa B na 40%. , na États-Unis). Bau ke kotisaka ntangu yonso eluate na kati ya kisina ya ba ion ya ESI, mpe bau ke fimpaka ba peptide ya tryptique mpe ba peptide yina kele na ba glycans ya GPI na nzila ya LTQ Orbitrap XL (spectromètre de masse hybride de trappe d’ion ions ligneux; Thermo Fisher scientifique). Na ntuala ya MS, ba tulaka ngolo ya kisina ya masa na 4,5 kV, mpe tiya ya masa ya kupesa na 300°C. Bau tulaka ngolo ya kapilere ti ngolo ya lense ya tuba na 15 V mpi na 50 V. 000. kukangama yina kekatukaka na kututana (CID)].
Ba nsangu ya MD me salama na kusadilaka logiciel ya GROMACS (52) mpe kisika ya ngolo ya MARTINI 2 (53-55). Na nima, bo sadilaka kisadilu mosi (56, 57) sambu na kutunga bima yina kele ti bima zole yina kele ti bima yina kele na kati na yo mpi bima yina ke vandaka na kati ya bima ya nkaka. Topologie na ba coordonnées ya Cer C26 me katuka na DXCE na kukatulaka ba mbuma ya nkaka na mukila ya sfingosine. Sadila mutindu yina beto me tubila na nsi sambu na kutula na ndonga couche zole mpi kusala yo, na nima sadila ba coordonnées ya nsuka ya ngidika sambu na kutunga ngidika yina kele ti Emp24. 173 tii na 193) yina bo tungaka bonso α-hélice na kusadilaka kisadilu ya MD (VMD) ya ke monanaka (58). Na nima, na nima ya kukatula mafuta yina vandaka kukangama, bo salaka proteine ​​yina na mutindu mosi ya fioti mpi bo kotisaka yo na kati ya ba couche zole na kusadilaka GUI ya CHARMM. 1202 ya DOPC na 302 ya C26 to 1197 ya DOPC na 295 ya C18 na Emp24. Kusala nde ngidika yina kukuma 0,150M. Bau salaka ba répliques iya ya kimpwanza sambu na ba couche zole.
Bau ketulaka bima zole ya mafuta na kisika na yau na kusadilaka mutindu ya CHARMM GUI, yina kelombaka kufiongunina mpe na manima kutula na kisika mosi bitambi 405 000, kisika bau kekulumusaka malembe-malembe mpe kekatulaka bima yina kekangaka nzila na kisika, mpe kitambi ya ntangu kemata katuka na 0,005 ps tii na 0,02 ps. Na nima ya kupesa kitezo, yau ke basisaka 6 μs na kitambi ya ntangu ya 0,02 ps. Na nima ya kukotisa Emp24, sadila mutindu mosi ya GUI ya CHARMM sambu na kufiotuna mpi kuyidika ngidika, mpi na nima sala 8 s na kisalu ya kusala.
Samu na ba nzila nyonso, na ntangu ya kisalu ya kupesa kitezo, ngolo ke twadisamaka na nzila ya ngolo ya Berendsen (59), mpe na ntangu ya kisalu ya kusala bima, ngolo ke twadisamaka na nzila ya ngolo ya Parrinello-Rahman (60). Na mambu nyonso, mpasi ya kati kati kele bar 1 mpe ba ke sadilaka nzila ya kukangama ya mpasi ya ndambu ya isotrope. Na nsungi ya kusala bima, bo kesadilaka kima mosi (61) yina kele ti vitesi ya kuvutukila sambu na kuvukisa tiya ya proteine, ya mafuta mpi ya bima yina kekatulaka tiya. Na ntangu ya kisalu yonso, tiya ya lukanu kele 310K. Kusalasana ya kukonda kukangama ketangamaka na kubasisa liste ya kuvukisa na kusadilaka ngidika ya Verlet na 0,005 ya kukanga ntima ya tampon. Bau ketangaka ngogo ya Coulomb na kusadilaka kisika ya mvingu ya bantu mpe ntama ya kuzenga ya 1,1 nm. Ngogo ya Vander Waals kesadilaka nzila ya kuzenga na ntama ya kuzenga ya 1,1 nm, mpe nzila ya kuzenga ya Verlet kesadilaka samu na kutambula ya ngolo (62).
Na kusadilaka VMD, nda ya banzadi ya kuzenga na kati ya bambuma ya fosfate ya DOPC to bambuma ya ceramide AM1 ti proteine ​​kele 0,7 nm, mpi bo ke tangaka ntalu ya mafuta yina ke vukanaka ti proteine. Na kutadila formule yai, sala calcul ya facteur ya kukonda-kukuma mvwama (DE) mutindu na (63): Facteur ya DE = (ntalu ya mafuta yonso na kati ya proteine ​​0,7) na kati ya proteine ​​0,7 (ntalu ya Cer na kati ya mafuta yonso) .
Bau kebakaka ntalu ya bo mepesa bonso mwayene, mpi ba barre ya bifu kele bakopi iya ya SE ya kele na kimpwanza. Nfunu ya ntalu ya kikuma ya DE ketangamaka na nzila ya t [(mwayene ya kikuma ya DE-1)/SE]. Kusala calcul ya ntalu ya P katuka na kukabula ya mukila mosi.
Bau sadilaka kisadilu ya GROMACS samu na kuzaba mukanda ya 2D ya mvingu ya bantu na nzila ya mvingu ya bantu yina kele na Emp24 na kati ya 250 ns ya nsuka ya mvingu ya bantu. Samu na kuzwa mukanda ya mvwama/kukonda ya ceramide, mukanda ya densité ya Cer ke kabuana na ntalu ya mukanda ya Cer na DOPC, na manima ke kabuana na ntalu ya Cer na nzutu. Bo ke sadilaka kiteso ya karte ya mukubu mosi.
Sambu na kuzwa bima ya nkaka sambu na disolo yai, tala http://advances.sciencemag.org.
Yai kele disolo mosi ya bantu yonso lenda kota mpi bo me kabulaka yo na nsi ya bansiku ya Nswa ya Kupesa Bima-Kukonda Kusala Bisalu, yina ke pesaka nswa ya kusadila, kukabula mpi kubasisa yo na konso mutindu yina, kana kusadila ya nsuka kele ve sambu na mbongo ya mumbongo mpi kana lukanu kele nde kisalu ya kisina kele ya mbote. Referansi.
Noti: Beto ke lomba nge kaka na kupesa adresi na nge ya e-mail sambu muntu yina nge ke pesa zina na yandi na lutiti kuzaba nde nge ke zola nde yandi mona e-mail yina mpi nde yo kele ve e-mail ya mbi. Beto ta kanga ve ata adresi mosi ya ba e-mail.
Ngiufula yai ke sadisamaka sambu na kumeka kana nge kele munzenza mpi kukanga nzila na kutinda bansangu ya mbi na mbala mosi.
Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero, Waga, Misako Arman, Miyako Riman, Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Kubaka bifwanisu ya 3D ya ngolo na ntangu ya kyeleka kemonisa mfunu ya nda ya nsinga ya ceramide sambu na kupona baproteine ​​na bisika ya kupona ya kubasisa.
Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero, Waga, Misako Arman, Miyako Riman, Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Kubaka bifwanisu ya 3D ya ngolo na ntangu ya kyeleka kemonisa mfunu ya nda ya nsinga ya ceramide sambu na kupona baproteine ​​na bisika ya kupona ya kubasisa.
©2020 Kimvuka ya Amerika sambu na Kuyela ya Siansi. banswa yonso kele ya bo me bumba. AAAS kele nduku ya HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CroixRef mpi COMPTEUR. 2375-2548.