Na ntangu yayi *Adrese ya ntangu yayi: Cologne 50931, Allemagne, Cologne Bansosa ya kimvuka ya bisalu ya mbote na yina me tala mvutu ya mpasi ya baselile na maladi ya ke katukaka na kununa (CECAD).
Bau ke monaka nde kubeba ya misisa ya nitu ya maladi ya mitokondrie lenda vutuka ve sambu ngolo ya misisa ya nitu ke vandaka fioti, kansi bantu me zaba ve mbote-mbote bupusi ya kukonda kusala mbote ya misisa ya nitu na mutindu baselile ke balulaka bima na nitu. Awa, beto ke kotisa proteome ya baselile ya ba neurone ya Purkinje yina kele ti kifu ya OXPHOS yina ke landa na kukuma mingi yina ke katukaka na kubeba ya ngolo ya kuvukana ya ba mitochondrie. Beto monaka nde kukonda kusala mbote ya mitokondrie kusalaka nde nsoba ya nene kusalama na mambu ya metala baproteine, mpi nsukansuka yo salaka nde baprograme ya sikisiki ya kesadisaka nitu na kusala kisalu na ndonga na ntwala nde baselile kufwa. Na mutindu mosi ya kukonda kuyindula, beto monaka mutindu ya pwelele ya kukota ya PCx mpi ya bima ya nkaka yina ke wakana ti kuyika bima ya kati-kati ya nzietelo ya TCA. Kukangama ya PCx ke kumisaka ngolo mpasi ya oxidation mpi kubeba ya misisa ya butomfu, yo ke monisa nde maladi ya misisa ya butomfu ke taninaka misisa ya butomfu yina ke vandaka ve ti OXPHOS. Kuvutula ya kuvukisa ya mitokondrie na ba neurone yina me beba na nsuka ke balulaka mpenza bikalulu yai ya ke sadisaka nitu na kusoba nitu, ebuna yo ke kangaka nzila na lufwa ya baselile. Mambu ya beto me mona ke monisa banzila yina bo zabaka ve ntete yina ke pesaka ngolo na kukanga ntima na maladi ya mitokondrie mpi ke monisa nde kubeba ya butomfu lenda baluka ata na nsuka ya maladi yai.
Mukumba ya nene ya mitokondrie na kutanina ngolo ya misisa ya butomfu kemonanaka mingi na bidimbu ya nene ya misisa ya butomfu yina kewakanaka ti maladi ya mitokondrie ya muntu. Maladi mingi na kati ya maladi yai ke katukaka na bansoba yina ke salamaka na ba gène yina ke twadisaka mutindu ba gène ke basikaka (1, 2) to na kufwa ya ba gène yina ke wakana ti mutindu ba gène ke salaka, yina ke vandaka ti bupusi ya mbi na mutindu ADN (mtDNA) ke vandaka ngolo (3, 4). Kisalu ya bo salaka na bifwanisu ya bambisi me monisaka nde sambu na kupesa mvutu na kukonda kusala mbote ya mitokondrie na bitini yina kele na nziunga, banzila ya ke taninaka nitu (5-7) lenda sala, ebuna yo lenda pesa bangindu ya mfunu na yina me tala mutindu maladi yai ya mpasi ke basikaka. Na kuswaswana mpenza, mutindu na beto ya kubakisa bansoba yina kesalamaka na nitu ya mitindu ya sikisiki ya baselile yina kekatukaka na kukonda kununga ya mvimba ya butomfu ya ntu kele mfunu mingi (8), mpi yo ketubila mingi mfunu ya kuzaba bankisi yina bo lenda sadila sambu na kubuya to kubuyisa maladi. Kukanga nzila na kubeba ya butomfu (9). Kukonda bansangu kele kieleka nde bantu mingi ke yindulaka nde baselile ya misisa ke vandaka ti ngolo fioti kibeni ya kusoba bima kana beto fwanisa yo ti mitindu ya baselile ya misisa yina kele na nziunga (10). Na kutadila mutindu baselile yai kesalaka kisalu ya nene na kuyidika mutindu ya kupesa bima yina kebasikaka na butomfu sambu na kusadisa na kupesa nsangu na nzila ya synapse mpi kupesa mvutu na mambu ya mputa mpi ya maladi, makuki ya kusoba mutindu baselile kebalulaka bima na mambu ya mpasi ya butomfu kele penepene kaka na baselile ya gliale ( 11-14 ). Diaka, mutindu baselile ya butomfu ke vandaka ya kuswaswana ke kangaka nzila mingi na kulonguka bansoba yina ke salamaka na bimvuka ya fioti ya butomfu ya butomfu. Yo yina, mambu fyoti mpamba mezabanaka sambu na malanda ya sikisiki ya baselile mpi ya bima yina kevandaka na nitu kana misisa ya butomfu kesalaka ve mbote.
Sambu na kubakisa mambu yina ke salamaka na nima ya kukonda kusala mbote ya misisa ya nitu, beto katulaka misisa ya Purkinje (PN) na bitini ya kuswaswana ya kubeba ya misisa yina ke katukaka na kufwa ya misisa ya nitu (Mfn2). Ata bansoba ya Mfn2 na bantu ke vandaka na kuwakana ti mutindu mosi ya maladi ya ntu yina ke katukaka na bantu yina me zabanaka na zina ya Charcot-Marie-Tooth ya mutindu 2A (15), kufwa ya Mfn2 na bampuku kele mutindu mosi ya me zabanaka mbote ya ke salaka nde nitu kusala ve mbote. Ba mitindu ya kuswaswana ya misisa ya butomfu (16-19) mpi mutindu ya kubeba ya misisa ya butomfu yina ke basikaka na nima ke vandaka ti bidimbu ya misisa ya butomfu yina ke landa na kukwenda na ntwala, mu mbandu maladi ya ke sadisaka na kutambula ve (18, 19) to ataxie ya butomfu ya ntu (16). Na kusadilaka kimvuka ya bametode ya proteomique ya kukonda bidimbu (LFQ), ya metabolomique, ya bifwanisu, mpi ya bametode ya kufwanisa maladi, beto kemonisa nde kubeba ya butomfu yina kekwendaka na ntwala kepusaka ngolo PCx (Pyruvate carboxylase) mpi mambu yankaka yina kevandaka na kati ya maladi ya misisa ya PN na in vivo Kumonisa ya ba enzyme. Sambu na kuzikisa mfunu ya mambu yai ya beto me mona, beto me kulumusa mpenza mutindu PCx ke basikaka na ba PN yina kele ve ti Mfn2, mpi beto me mona nde operasio yai ke kumisaka ngolo mpasi ya oxidation mpi ke kumisaka nswalu kubeba ya misisa, ebuna yo ke monisa nde azoospermie ke pesaka lufwa ya baselile. Kumonisa ya ngolo ya MFN2 lenda gulusa mpenza PN ya kubeba ya nsuka ti kukonda ngolo ya OXPHOS, kudya mingi ya ADN ya mitokondrie, mpi réseau ya mitokondrie yina kemonana nde yo mebeba, yina kemonisa dyaka nde mutindu yai ya kubeba ya misisa ya butomfu lenda beluka nkutu na ntwala nde maladi ya baselile kukuma ngolo.
Na kumona na mabanza mutindu mitokondrie kele na PN ya kufwa ya Mfn2, beto sadilaka mutindu mosi ya mputa yina ke pesaka nzila na mitokondrie yina ke sadilaka Cre na kukanga nzila na proteine ​​ya jaune ya ke sema (YFP) (mtYFP) (20) mutindu Cre ke basikaka mpi beto tadilaka mutindu mitokondrie ke vandaka na nitu. Beto me mona ti kufwa ya gène ya Mfn2 na ba PNs ke nata kukabwana ya malembe-malembe ya réseau ya ba mitokondrie (Kifwanisu S1A), mpe nsobolo ya ntete me monana na ba mposo 3 ya mvula. Na kuswaswana, kubeba ya nene ya couche ya baselile ya PN, mutindu yau kemonanaka na kuvidisa ya mvingu ya bantu ya Calbindin, kubandaka ve tii na bamposo 12 ya mvula (Kifwanisu 1, A mpe B). Kukonda kuwakana ya ntangu na kati ya bansoba ya ntete ya mutindu mitokondrie kevandaka mpi luyantiku ya kemonanaka ya lufwa ya misisa ya butomfu kupusaka beto na kusosa kuzaba bansoba ya kesalamaka na nitu yina kekatukaka na kukonda kusala mbote ya mitokondrie na ntwala ya lufwa ya baselile. Beto salaka nzila mosi ya kusadila sambu na kukatula PN yina ke monisaka YFP (YFP+) (Kifwanisu 1C), mpi na bampuku yina bo ke twadisaka (Mfn2 + / loxP :: L7-cre), yina bo ke bingaka na nima CT1BRL (Kifwanisu). Kubongisa mbote-mbote nzila ya kukanga bakielo yina me simbama na ngolo ya fioti ya kidimbu ya YFP ke pesa beto nzila ya kusukula nitu ya YFP+ (YFPhigh) ya ba PN na ba yina kele ve ba PN (YFPneg) (Kifwanisu S1B) to na bitini ya axon/dendrite ya ke pesa nsemo yina bo ke yindulaka nde yo kele (YFPlow; Kifwanisu S1D, na diboko ya kimama). Samu na kuzikisa kimuntu ya bantu yina ba me tula na ndonga, beto salaka ba nsangu ya LFQ mpe na manima ba nsangu ya bima ya mfunu, mpe beto monaka ti kele na kukabwana ya pwelele na kati ya baselile ya YFPhigh mpe ya YFPneg (Kifwanisu S1C). 21, 22), kansi ata kimvwama mosi ve ya ba proteine ​​yina ke basikaka mingi na ba neurone to na mitindu ya nkaka ya baselile (Kifwanisu 1D) ). Kufwanisa na kati ya ba mbandu na ba cellule YFPhigh ya kukangama yina ba me vukisa na ba kumeka ya kimpwanza monisaka coefficient ya nguizani> 0,9, ke monisa kubuta ya mbote na kati ya ba mvutukulu ya biolozi (Kifwanisu S1E). Na bunkufi, bansangu yai ndimisaka pula na beto ya kukatula PN yina lenda salama na mutindu mosi ya ngolo mpi ya sikisiki. Sambu ngidika ya kunata L7-cre yina bo ke sadilaka ke pusaka na kuvukisa diaka ba mosaïque na mposo ya ntete na nima ya kubuta (23), beto yantikaka kufwa ba nsusu na CTRL mpi na mutindu ya ke lomba nde bo vukisa ba neurone. Na nima ya kumanisa kuvukisa diaka, bo ke bingaka yo Mfn2cKO na bamposo 4 ya mvula. Na nsuka, beto ponaka bamposo 8 ya mvula ntangu couche ya PN vandaka kaka ya kukangama ata bitini ya mitokondrie vandaka kumonana pwelele (Kifwanisu 1B na Kifwanisu S1A). Na kimvuka, beto me tanga ntalu ya ba proteine ​​3013, na kati na yau kitezo ya 22% me simbama na ba nsangu ya MitoCarta 2.0 yina me simbama na ba nsangu ya mvingu ya bantu mutindu ba mvingu ya bantu (Kifwanisu 1E) (Kifwanisu 1E) (24). Kufiongunina ya mutindu ya kumonisa ba gènes ya kuswaswana yina salamaka na mposo ya 8 monisaka ti kaka 10,5% ya ba proteine ​​nyonso vuandaka na ba nsobolo ya nene (Kifwanisu 1F na Kifwanisu S1F), na kati ya yau ba proteine ​​195 vuandaka na ntuala mpe ba proteine ​​120 vuandaka na ntuala (Kifwanisu 1F). Yau kele mfunu na kuzaba nde “kufimpa nzila ya mpa” ya kimvuka yai ya bansangu kemonisa nde ba gènes yina kemonisamaka na mitindu ya kuswaswana kele mingimingi ya kimvuka mosi ya banzila ya sikisiki ya metabolique (Kifwanisu 1G). Kima ya kebenda dikebi kele nde, ata kukulumuka ya banzila yina kewakana ti OXPHOS mpi kupesa bidimbu ya calcium kendimisa nde bo mesala nde mitokondrie kusala ve mbote na PN yina kevandaka ve ti fusion, mitindu yankaka yina ketadilaka mingimingi kubalula ba acide aminé kevandaka ti bandilu ya zulu mingi, yina kewakana ti kubalula ya mitokondrie P yina kesalamaka. Kuvutula bansinga kele mutindu mosi. kukonda kusala mbote.
(A) Bafoto ya ke monisa bitini ya butomfu ya ntu ya bampuku ya CTRL mpi ya Mfn2cKO yina ke monisa kuvidisa malembe-malembe ya ba PN (calbindine, gris); bo vandaka kutula mukubu na DAPI. (B) Kutanga ntalu ya (A) (kufiongunina ya nzila mosi ya kuswaswana, ***P<0,001; n = 4 tii na 6 ya ba nzungu tatu). (C) Kusala kisalu ya kumeka. (D) Kukabula ya karte ya tiya ya bidimbu ya sikisiki ya Purkinje (na zulu) mpi mitindu yankaka ya baselile (na kati-kati). (E) Kifwanisu ya Venn yina ke monisa ntalu ya ba proteine ​​ya mitokondrie yina bo me zaba na PN yina bo me tula na ndonga. (F) Kifwanisu ya volkan ya baproteine ​​yina bo ke monisaka na mitindu ya kuswaswana na misisa ya butomfu ya Mfn2cKO na bamposo 8 (ntalu ya kuzenga ya mfunu ya 1,3). (G) Kufiongunina nzila ya kuganga ke monisa ba nzila tanu ya mfunu ya kutombula (mbwaki) mpe kukulumuka (bule) na PN ya Mfn2cKO yina me tulama na ndonga ya bamposo 8. Bo ke monisaka nivo ya mwayene ya konso proteine ​​yina bo me mona. Karti ya tiya ya gris: ntalu ya P ya kuyidika. ns, mfunu ve.
Bansangu ya baproteine ​​monisaka nde malembe-malembe mutindu baproteine ​​yina ke basikaka na nitu ya I, III, mpi IV ke basikaka. Ba nsangu ya I, III, mpe IV nyonso vuandaka na ba nsangu ya mfunu ya mtDNA, na ntangu yina nsangu ya II, yina vuandaka kaka na nsangu ya nikleyere, vuandaka na kisina ya kusimba ve (Kifwanisu 2A mpe Kifwanisu S2A). . Na kuwakana ti bamvutu ya proteomique, immunohistochimie ya bitini ya misisa ya butomfu ya ntu monisaka nde nivo ya MTCO1 (unité 1 ya cytochrome C oxydase) ya kimvuka ya IV na PN vandaka kukita malembe-malembe (Kifwanisu 2B). Bau kulumusaka mingi kitini ya mtDNA Mtatp8 (Kifwanisu S2A), na ntangu yina nivo ya kisika ya kukangama ya kitini ya ATP ya kukangama ya nikleyere bikalaka ya kusoba ve, yina ke wakana ti kimvuka ya fioti ya ATP ya kukangama yina me zabana F1 ntangu mtDNA ke basikaka ya kukangama. Kusala mambu ke wakana. Kuzenga (7). Kutadila kiteso ya ADN na ba PN ya Mfn2cKO yina bo me pona na nzila ya qPCR (qPCR) ndimisaka nde ntalu ya bakopi ya ADN ke kulumuka malembe-malembe. Na kufwanisa na kimvuka ya bantu yina bo vandaka kutala, na bamposo 8, kaka kiteso ya 20% ya nivo ya mtDNA vandaka kubumbana (Kifwanisu 2C). Na kuwakana ti bamvutu yai, kutula mukubu ya mikroskopi ya ke talana ti ba PN ya Mfn2cKO sambu na kuzaba ADN ke monisa mutindu ba nucléotides ya mitokondrie ke diaka na kutadila ntangu (Kifwanisu 2D). Beto me mona nde kaka bantu ya nkaka yina ke salaka kisalu ya kubebisa ba proteine ​​ya mitokondrie mpi ya kupesa mvutu na ba mpasi ya nitu vandaka ti bansiku ya ngolo, mu mbandu Lonp1, Afg3l2 mpi Clpx, mpi bima ya ke vukisaka bima ya mpasi ya OXPHOS. Ba nsobolo ya nene ve na kitezo ya ba proteine ​​yina ke kotaka na apoptose me monana (Kifwanisu S2B). Mutindu mosi, beto monaka nde banzila ya mitokondrie mpi ya réticulum endoplasmique yina ke kotaka na kisalu ya kunata calcium ke vandaka kaka ti bansoba ya fioti (Kifwanisu S2C). Na zulu ya mambu yina, kutadila ba proteine ​​yina ke tadila kudia nitu ya muntu mosi monaka ve bansoba ya nene, yina ke wakana ti kukota ya ke monana ya ba nitu yina ke diaka nitu ya muntu mosi yina bo monaka na nitu na nzila ya immunohistochimie mpi ya mikroskopi ya ba électroniques (Kifwanisu S3). Kansi, kukonda kusala mbote ya OXPHOS yina kekwendaka na ntwala na ba PN kekwendaka nzila mosi ti bansoba ya pwelele ya kesalamaka na zulu ya ntu. Ba kimvuka ya ba mitokondrie lenda kumonana na nitu ya ba cellule na ba nti ya ba PN ya Mfn2cKO yina kele na ba mvula 5 na 8, mpe ntuadisi ya kati ya ba nsinga me soba mingi (Kifwanisu S4, A na B). Na kuwakana ti bansoba yai ya zulu-zulu mpi kukulumuka ya nene ya mtDNA, kufimpa ya bitini ya ntu ya ntu ya ngolo ti ntu ya ntu ya ntu (TMRM) monisaka nde ngolo ya ntu ya ntu ya ntu na ba PN ya Mfn2cKO kulumukaka mingi (Kifwanisu S4C).
(A) Kutadila ntangu ya nivo ya kutuba ya kimvuka ya OXPHOS. Tadila kaka ba proteine ​​yina kele na P<0,05 na ba mposo 8 (ANOVA ya ba nzila zole). Ligne ya matonsi: Kusoba ve kana beto fwanisa yo ti CTRL. (B) Na diboko ya kimama: Mbandu ya kitini ya butomfu ya ntu yina bo me sonika ti bima yina ke nwanaka ti MTCO1 (barre d’échelle, 20 μm). Kisika yina nitu ya baselile ya Purkinje ke vandaka me fuluka ti mukubu ya jaune. Na diboko ya kibakala: Kutanga ntalu ya MTCO1 (kufiongunina na nzila mosi ya kuswaswana; n = 7 tii na 20 ya baselile yina bo me fiongunina na ba nsusu tatu). (C) qPCR ya kufiongunina ntalu ya bakopi ya mtDNA na PN ya kupona (kufiongunina ya nzila mosi ya kuswaswana; n = 3 tii na 7 ya bampuku). (D) Na diboko ya kimama: Mbandu ya kitini ya butomfu ya ntu yina bo me sonika kima mosi ya ke nwanaka ti ADN (barre d’échelle, 20 μm). Kisika yina nitu ya baselile ya Purkinje ke vandaka me fuluka ti mukubu ya jaune. Na diboko ya kibakala: Kutanga ntalu ya ba mputa ya mtDNA (kufimpa ya nzila mosi ya kuswaswana; n = baselile 5 tii na 9 ya ba nsusu tatu). (E) Mbandu ya kitini ya ntu ya ntu yina ke monisa baselile ya mitoYFP + ya Purkinje (fleche) na enregistrement ya pense ya baselile ya mvimba. (F) Kutanga ntalu ya IV. (G) Ba nsangu ya ke monisa mutindu bo me tula nsinga ya ke katulaka ngolo na baselile ya CTRL mpi ya Mfn2cKO. Trace ya zulu: Pulse ya ntete yina me basisa AP. Kulanda na nsi: Mbala ya AP ya kuluta mingi. (H) Kutanga ntalu ya bima yina ke basikaka na nima ya ntu (sPSP). Trace ya enregistrement ya kimonisi mpe ratio ya zoom na yau me monisama na (I). Kufiongunina ya nzila mosi ya kuswaswana kutadilaka n = 5 tii na baselile 20 ya bampuku tatu. Ba nsangu ke monisama na mutindu ya mwayene±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Ba trace ya ke monisa AP ya kukonda kukana yina bo me sonikaka na kusadilaka mutindu ya pense ya bo me tobula. Trace ya zulu: Mbala ya AP ya kuluta mingi. Kulanda na nsi: zoom ya AP mosi. (K) Kutanga ntalu ya mwayene mpi ya mingi ya AP na kutadila (J). Kimenga ya Mann; n = 5 baselile me fiongunina na ba nsusu iya. Ba nsangu ke monisama na mutindu ya mwayene±SEM; mfunu ve.
Bau monaka kubeba ya pwelele ya OXPHOS na PN ya Mfn2cKO ya bamposo 8, yina kemonisa nde kisalu ya nitu ya ba neurone kele ya kukonda mbote mpenza. Na yina, beto fimpaka bifu ya kura ya kukonda ngolo ya ba neurones ya kukonda OXPHOS na bamposo 4 tii na 5 mpi na bamposo 7 tii na 8 na kusalaka ba enregistrement ya pense ya nsinga ya baselile ya mvimba na bitini ya ntu ya ntu ya ngolo (Kifwanisu 2E). Na mutindu mosi ya kukonda kuyindula, ngolo ya membrane ya kupema ya mwayene mpi ngolo ya kukota ya ba neurone ya Mfn2cKO vandaka kiteso mosi ti yina bo vandaka kutala, ata luswaswanu ya fioti vandaka na kati ya baselile (Tableau 1). Mutindu mosi, na ba mposo 4 ti 5, ba nsobolo ya nene ve na nguizani na kati ya courant-voltage (courbe IV) me monana (Kifwanisu 2F). Kansi, ata neurone mosi ve ya Mfn2cKO ya bamposo 7 tii na 8 gulukaka na nzila ya IV (etape ya kukangama mingi), yina ke monisa nde kele ti mpasi ya pwelele ya kukangama ngolo na kitini yai ya nsuka. Na kuswaswana, na ba nsinga ya Mfn2cKO, ba nsinga ya ke katulaka ngolo yina ke salaka nde ba nsinga ya ngolo ya kusala mambu (AP) kubasika ke ndimamaka mbote, yo ke monisa nde mutindu na bo ya kubasisa masa na kimvuka me swaswana ve mingi ti yina ya ba nsinga ya ntu yina ke twadisaka mambu yina ke salaka bamposo 8 (Tableau 1 mpi Kifwanisu 2G). Mutindu mosi, mbala na ngolo ya ba nzila ya mvingu ya bantu (sPSCs) vuandaka mutindu mosi na yina ya kimvuka ya luyalu, mpe mbala ya mambu vuandaka kuma mingi katuka na bamposo 4 tii na bamposo 5 tii na bamposo 7 tii na bamposo 8 na kukula ya mutindu mosi (Kifwanisu 2, H na I). Nsungi ya kuyela ya misisa na PN (25). Ba mvutu ya mutindu mosi bakamaka na nima ya kutula ba PNs ya kutobula. Kuyidika yai kekangaka nzila na kuyidika mambu yina lenda salama sambu na bifu ya ATP ya baselile, mutindu yo lenda salama na enregistrement ya pense ya baselile ya mvimba. Na kutuba ya mbote, ngolo ya membrane ya kupema mpi mbala ya kubula ya mbala mosi ya ba neurone ya Mfn2cKO vandaka ve ti bupusi (Kifwanisu 2, J mpi K). Na bunkufi, bamvutu yai ke monisa nde ba PN yina kele ti kifu ya OXPHOS ya ke monana pwelele lenda kanga ntima mbote na mitindu ya kubasisa masa na ba frequence ya ngolo, yo ke monisa nde kele ti mutindu mosi ya kufuta mbongo yina ke pesaka bo nzila ya kutanina bamvutu ya pene-pene ya mutindu ya mbote.
Ba nsangu ke monisama na mutindu ya mwayene ± SEM (kufiongunina ya nzila mosi ya kuswaswana, kumeka ya kufwanisa mingi ya Holm-Sidak; *P<0,05). Nimero ya unité ke monisamaka na ba parenthèses.
Beto me tula na ntuala samu na kusosa kuzaba kana konso ndonga na kati ya ba nsangu ya proteomique (Kifwanisu 1G) kele na ba nzila yina lenda kunwanisa kukonda ya ngolo ya OXPHOS, na mutindu yina kutendula samu na yinki PN yina me beba lenda tanina fisiolozi ya ngolo ya pene-pene (Kifwanisu 2, E tii na K). . Kufiongunina ya ba proteomique monisaka ti ba enzymes yina ke kotaka na kati ya ba acides aminés ya ba branchés (BCAA) vuandaka na ntuala mingi (Kifwanisu 3A mpe Kifwanisu S5A), mpe kima ya nsuka yina ke basikaka na nzila ya mvingu ya bantu lenda yika na ba mvingu ya bantu na kati ya ba mvingu ya bantu. Beto monaka nde ntalu ya BCAA 1 (BCAT1) mpi ya BCAT2 yonso zole kumaka mingi. Bo salaka nde kitambi ya ntete ya BCAA kusalama na mutindu bo basisaka bima yina ke katukaka na α-cetoglutarate ( 26 ). Ba subunités nyonso yina ke salaka kimvuka ya ba nsinga ya ba nsinga ya ba nsinga (BCKD) ke tambulaka na zulu (kimvuka ke sadisaka na ku katula ba nsinga ya BCAA yina ke basikaka na nima mpe yina lenda vutuka ve) (Kifwanisu 3A mpe Kifwanisu S5A). Kasi, ata nsobolo mosi ve ya pwelele na BCAA yandi mosi me monana na PN yina ba me pona, yina lenda salama samu na kukula ya ba cellules ya ba acides aminés yayi ya mfunu to kusadila ba nzila ya nkaka (glucose to acide lactique) samu na ku yika na nzila ya TCA (Kifwanisu S5B). Ba PN yina kele na OXPHOS ve monisaka mpe bisalu ya kubeba ya mvingu ya bantu mpe ya kupesa mvingu ya bantu na mposo 8, yina lenda monisama na kutombula ya mvingu ya bantu (GLS) mpe mvingu ya bantu (GPT2) (Kifwanisu 3, A mpe C). Yau kele mfunu na kuzaba nde ntungulu ya GLS kele kaka na zulu ya ntungulu ya GLS (kusoba ya Mfn2cKO/CTRL kele kiteso ya mbala 4,5, P = 0,05), mpi ntungulu na yau ya sikisiki na kati ya mikanda ya kansere Lenda kusadisa mitokondrie ya kansere. (27).
(A) Karti ya tiya ke monisa nsoba ya mbala na mbala ya nivo ya proteine ​​sambu na nzila yina bo me tubila na bamposo 8. (B) Mbandu ya kitini ya butomfu ya ntu yina bo me sonika ti bima yina ke nwanaka ti PCx (barre d’échelle, 20 μm). Fleche ya jaune ke monisa nitu ya selile ya Purkinje. (C) Kufimpa mutindu ba proteine ​​ke basikaka na ntangu yina bo me zaba nde yo kele muntu ya mfunu sambu na kubelula maladi ya misisa (ekzame t mingi, *FDR <5%; n = bampuku 3-5). (D) Na zulu: Kifwanisu ya ke monisa mitindu ya kuswaswana ya kukotisa carbone yina bo me tula kidimbu yina kele na kati ya nsadisa ya [1-13C] (disongidila, na nzila ya PDH to nzila ya ke lutaka na nzila ya misisa). Na nsi: Tablo ya violon ke monisa ntalu ya carbone mosi (M1) yina me baluka na aside aspartique, aside citrique mpe aside malique na manima ya kutula bidimbu na bitini ya ntu ya ntu ya ngolo na [1-13C]pyruvate (test t ya zole; ** P <0,01). (E) Kutadila mbote-mbote disolo ya ntangu ya nzila yina bo me songa. Tadila kaka ba proteine ​​yina kele na P<0,05 na bamposo 8 . Line ya kukangama: ata ntalu ya kuyidika ve (kufiongunina ya mitindu zole ya luswaswanu; * P <0,05; *** P <0,001). Ba nsangu ke monisama na mutindu ya mwayene±SEM.
Na kutadila na beto, BCAA me kumaka mosi na kati ya banzila ya mfunu ya kuyidika mambu. Kieleka yayi ke pesa ngindu ya ngolo ti volime ya mupepe yina ke kota na nzila ya TCA lenda soba na PN yina ke konda OXPHOS. Yau lenda monisa mutindu mosi ya nene ya kuvutula bansinga ya ntu, yina lenda vanda na bupusi ya mbala mosi na fiziolozi ya ntu mpi na luzingu na ntangu ya kutanina mpasi ya ngolo ya OXPHOS. Na kuwakana ti ngindu yai, beto monaka nde enzyme ya nene ya ke sadisaka na kukanga misisa ya menga PCx ke vandaka na zulu (Mfn2cKO/CTRL ke sobaka kiteso ya mbala 1,5; Kifwanisu 3A), yina ke sadisaka na kubalula ba pyruvate na oxaloacétate (28), yina bo ke yindulaka nde yo kele na kati ya misisa ya ntu. 30). Na kuwakana ti bamvutu ya proteomique, mikroskopi ya ke monanaka na zulu ya ntu monisaka nde PCx vandaka kumonana mingi na mutindu mosi ya sikisiki mpi ya nene na ba PN yina vandaka ve ti OXPHOS, kansi PCx yina vandaka kupesa mvutu vandaka mingi-mingi na baselile ya glial ya Bergmann yina vandaka pene-pene ya kisika yina bo vandaka kutala (Kifwanisu 3B). 1-13C], beto sadilaka bima yina ke sadisaka na kuzaba mambu yina ke salamaka na nitu. Ntangu bo vandaka kuyoka masa na nzila ya PDH, kidimbu na yo ya isotope vandaka kuvila , Kansi yo ke kotaka na kati ya bima ya kati-kati ya nzietelo ya TCA ntangu masa ke balukaka na nzila ya bima yina ke basikaka na misisa (Kifwanisu 3D). Na kupesa maboko na ba nsangu na beto ya proteomique, beto monaka ntalu ya mingi ya ba kidimbu ya ke katuka na traceur yayi na kati ya aside aspartique ya ba nsinga ya Mfn2cKO, na ntangu yina aside citrique na aside malique mpe vuandaka na tendance ya kati kati, ata yau kele mfunu ve (Kifwanisu 3D).
Na kati ya misisa ya ntu ya MitoPark yina kele ti maladi ya ntu yina kekatukaka na misisa ya ntu yina kebebisaka mpenza gène A (Tfam) (Kifwanisu S6B), PCx vandaka mpi ya kuyidika mbote (31), yina kemonisa nde maladi ya ntu yina kekatukaka na misisa ya nitu yina kekatukaka na misisa ya nitu yina kebebisaka misisa ya nitu ( OKSFOS na nitu. Yau kele mfunu na kuzaba nde yau memonanaka nde ba enzyme ya kuswaswana (32-34) yina lenda basika na misisa ya butomfu yina lenda vanda na kuwakana ti maladi ya misisa ya menga kevandaka ti kiyeka ya nene na ba PN yina kevandaka ve ti OXPHOS, mu mbandu, ba enzyme ya kekatukaka na misisa ya nitu (PCC-A), ba enzyme ya kekatukaka na misisa ya nitu yina kebalulaka misisa ya butomfu. enzyme 3 (ME3), yina kisalu na yau ya nene kele ya kuvutula pyruvate na malate (Kifwanisu 3, A na C) (33, 35). Na zulu ya mambu yina, beto monaka kukula ya nene ya enzyme Pdk3, yina ke fosforilaka mpe na mutindu yina ke kangaka PDH (36), na ntangu yina ata nsobolo mosi ve monanaka na enzyme Pdp1 yina ke salaka PDH to na kimvuka ya enzyme ya PDH yau mosi (Kifwanisu 3A). Na mutindu mosi, na ba PN ya Mern2cKO, bo me kumisaka ngolo fosforilasio ya α1 ya α (PDHE1α) ya α1 ya α (Kifwanisu S6). Pyruvate kele ve ti nzila ya kukota na misisa.
Na nsuka, beto monaka nde nzila ya nene ya biolozi ya serine mpi ya glycine, nzietelo ya folate (1C) ya ke wakana ti yo mpi ya biolozi ya proline (Kifwanisu 1G mpi Kifwanisu S5C) yonso ke vandaka ya kuyidika mbote-mbote, na kutadila bansangu, na ntangu ya kisalu ya kupesa ngolo. Ba nsinga ya nziunga ke salaka ti misisa ya nitu ( 5-7 ). Kufimpa ya ke pesa maboko na bansangu yai ya proteomique monisaka nde na PN yina OXPHOS kele ve, bo tulaka bitini ya butomfu ya ntu ya bampuku ya bamposo 8 na nsadisa ya SHMT2, yina kele enzyme ya mfunu ya ke sadisaka na kusala mambu yina ke sadisaka nitu na kukangama ngolo. Mvutu ya mfunu ya nitu (Kifwanisu S5D). Na kati ya ba nsinga ya nsinga ya ntu ya ntu yina bo me tula na sukadi, ba eksperiansi ya kulanda mambu yina ke salamaka na kati ya nitu me ndimisa diaka nde bo ke twadisaka mbote-mbote bima yina ke basikaka na nitu, yo ke monisa nde ntalu ya bima yina ke basikaka na nitu ke kumaka mingi (Kifwanisu S5E). Sambu mambu yina GLS mpi GPT2 ke sadisaka ke vandaka ti mukumba ya kusala nde bima yina ke katukaka na nitu mpi yina ke salaka nde bima yina kele na kati na yo mpi α-ketoglutarate, mutindu bo ke yidikaka yo ke monisa nde baselile yina ke vandaka ve ti OXPHOS ke vandaka ti mfunu mingi ya bima yina ke vandaka na kati ya nitu ( Na kuswaswana ti bansoba yai, lusalusu mosi ya proteomique ya ba astrocytes ya butomfu ya ntu yina katukaka na ba nsusu ya Mfn2cKO yina kele ti PN monisaka nde banzila yai (yina kele ti ba antioxydase yonso) sobaka ve mingi na mutindu ya kumonisa mambu, yo yina yo monisaka nde Kubalula yai ya nitu ke ponaka na PN yina me beba na D na G (Kifwanisu S6).
Na bunkufi, bansosa yai monisaka mitindu ya kuswaswana mingi ya kupesa ngolo na ntangu ya banzila ya sikisiki ya metabolique na ba PN. Ata kisalu ya kukonda mbote ya misisa ya butomfu lenda nata na kubebisa misisa ya ntu na ntwala mpi na kuyidika diaka 1C (Kifwanisu 3E mpi Kifwanisu S5C), mpi nkutu bansoba yina bo lenda tuba na ntwala na yina me tala mutindu ba complexe I mpi IV ke basikaka, bansoba yina ke salamaka na mutindu ya kuvukisa misisa ya butomfu kele kaka Yo monanaka kaka na nsuka ya stage. Kukonda kusala mbote ya OXPHOS (Kifwanisu 3E na Kifwanisu S5C). Ba mvutu yayi ke tendula mutindu ya kulandana yina ba mitochondrie (cycle 1C) mpe ba cytoplasme (biosynthèse sérine) yina ke katukaka na mpasi ke pesa mvutu na mutindu mosi na kukula ya ba mpasi ya misisa na cycle ya TCA samu na kuyidika diaka mutindu ya kusadila misisa ya butomfu.
Ba PN ya kukonda OXPHOS ya bamposo 8 lenda tanina kisalu ya kupesa kikesa mingi mpi kusala réconnexion métabolique ya nene sambu na kufuta mpasi ya mitokondrie. Kusengumuna yai kebasisa dibaku mosi ya kebenda dikebi nde ata na ntangu yai, baselile yai lenda Baka mpi lusansu sambu na kukanga to kukanga nzila na kubeba ya butomfu. Nsukinina. Beto manisaka dibaku yayi na nzila ya bisalu zole ya kimpwanza. Na mutindu ya ntete, beto salaka nzila ya mvingu ya bantu (AAV) na mpila nde MFN2 lenda monisama na mutindu ya kupona na ba PN ya kukonda OXPHOS na kati ya nitu (Kifwanisu S7A). Bau zikisaka AAV yina ke pesaka bakode na MFN2 mpi mCherry yina ke pesaka bansangu ya ke sema (Mfn2-AAV) na ba culture ya ntete ya misisa ya butomfu na in vitro, yina salaka nde MFN2 kubasika na mutindu mosi ya ke tadila Cre mpi kugulusa mutindu ya kutunga misisa ya butomfu, ebuna yo kangaka nzila na kubaluka ya misisa ya butomfu na Mfn2, B Kifwanisu ya S7). Na nima, beto salaka ba eksperiansi ya in vivo sambu na kupesa na mutindu ya kukonda kuyindula Mfn2-AAV ya bamposo 8 na ntu ya ntu ya Mfn2cKO mpi ya bampuku ya kulandila, mpi beto tadilaka bampuku ya bamposo 12 (Kifwanisu 4A). Ba nsusu ya Mfn2cKO yina ba sansaka me fwa (Kifwanisu 1, A na B) (16). Kubalula ya virisi na kati ya nitu me sala nde PN kubasika na mutindu ya kupona na ba nziunga ya nkaka ya butomfu ya ntu (Kifwanisu S7, G mpi H). Kutula ntunga ya AAV ya kulandila yina ke monisaka kaka mCherry (Ctrl-AAV) vandaka ve ti bupusi ya nene na kiteso ya kubeba ya butomfu na bibulu ya Mfn2cKO. Na kuswaswana, kufiongunina ya ba Mfn2cKO yina bo me balula na Mfn2-AAV monisaka bupusi ya nene ya lutaninu ya couche ya baselile ya PN (Kifwanisu 4, B mpi C). Mingimingi, ntalu ya ba neurone ke monana nde yo lenda swaswana ve pene-pene ti bambisi yina bo ke talaka (Kifwanisu 4, B mpi C, mpi Kifwanisu S7, H mpi I). Kumonisa ya MFN1 kansi ya MFN2 ve kele mbote mutindu mosi na kugulusa lufwa ya ba neurone (Kifwanisu 4C mpe Kifwanisu S7, C mpe F), yina ke monisa ti kumonisa ya MFN1 ya nganda ya divumu lenda kuyidika mbote-mbote kukonda ya MFN2. Kufimpa yankaka na nivo ya PN mosi monisaka nde Mfn2-AAV gulusaka mingi-mingi ntungulu ya zulu ya mitokondrie, kumisaka nivo ya mtDNA ya mbote, mpi kuvutulaka na nima mutindu ya kumonisa mingi ya PCx yina ke sadisaka na kukanga menga (Kifwanisu 4, C tii na E ). Kutala na meso ba nsusu ya Mfn2cKO yina ba gulusaka na kifulu ya kupema monisaka ti mutindu ya kulala na bawu mpe bidimbu ya bawu ya kutambula (muvema S1 tii na S3) me tomaka. Na nsuka, ba eksperiansi yai ke monisa nde kukotisa diaka MFN2 na nima ya ntangu na ba PN yina kele ti kifu ya ngolo ya OXPHOS me fwana sambu na kuvutula mtDNA yina bo ke diaka mpi kunata maladi ya mikwa, ebuna yo ke kangaka nzila na kubeba ya ba axon mpi na lufwa ya ba neurone na in vivo.
(A) Mutindu mosi ya ke monisa manaka ya kumeka sambu na kutula AAV yina ke kotisaka MFN2 ntangu nzila ya metabolique yina bo me monisa ke sala. (B) Bafoto ya ke monisa bitini ya butomfu ya ntu ya bamposo 12 yina bo me balula ti bampuku ya Mfn2cKO na bamposo 8 mpi yina bo me tula bidimbu ti bima yina ke nwanaka ti Calbindin. Na diboko ya kitata: Kusala bansinga ya axon. Ntalu ya mvingu ya bantu kele 450 na 75 μm. (C) Na diboko ya kimama: Kutanga ntalu ya baselile ya Purkinje na kati ya nzila ya kubalula ya AAV (AAV+) (kufimpa ya nzila mosi ya kuswaswana; n = 3 bampuku). Na diboko ya kitata: kufiongunina ya mtDNA na PN yina bo me balula na mposo ya 12 (t-test ya kukonda kuvukisa; n = baselile 6 ya bampuku tatu). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Bafoto ya fioti ya ke monisa mutindu ya kupesa bansangu ya PN ya bitini ya butomfu ya Mfn2cKO yina bo me balula ti ba vecteur viral yina bo me monisa. Maske ya rose ke monisa kisika yina ba dendrite ke bakaka, mpi kisika ya jaune ya kele ti matonsi ke monisa zoom yina bo me pesa na diboko ya kitata; n ke monisa nsuka ya ntoto. Barre ya nene, 1μm. (E) ke monisa mbandu ya PCx ya kutula mukubu na PN yina bo me balula na bamposo 12. Barre ya nene, 20μm. OE, kutuba mambu kuluta ndilu; FC, nsoba ya zulu.
Na nsuka, beto sosaka kuzaba mfunu ya kuguluka ya baselile yina ke katukaka na peroxydase na ba PN yina me kutanaka ti maladi ya OXPHOS. Beto salaka mCherry yina ke pesaka bakode na ARN ya nkufi (ARN ya nkufi) yina ke tadilaka mingi-mingi ARN ya PCx ya mpuku (AAV-shPCx), mpi beto tulaka virisi to ngidika na yo ya bo me vukisaka (AAV-scr) na kati ya butomfu ya mpuku ya Mfn2cKO. Bau salaka ntunga na mposo ya iya ya mvula (Kifwanisu 5A) samu na kuzwa PCx ya kufwa mbote na ntangu yina mvingu ya PCx vuandaka kuma mingi (Kifwanisu 3C) mpe couche ya ba cellule ya PN vuandaka kaka ya kukangama (Kifwanisu 1A). Yau kele mfunu na kuzaba ti kufwa PCx (Kifwanisu S8A) kenataka nswalu mingi ya lufwa ya PN, yina kele kaka nsinga ya kukangama ya kimbevo (Kifwanisu 5, B na C). Na nsadisa ya kubakisa mutindu mambu ya ke salamaka na nitu yina ke katukaka na PCx, beto longukaka kikalulu ya redox ya ba PN na nima ya kufwa ya PCx mpi bo monisaka na mbala mosi (Kifwanisu S8, B tii na D). Na nima, beto salaka mikroskopi ya bifwanisu ya luzingu ya mvimba (FLIM) na bitini ya butomfu ya ngolo ya Mfn2cKO ya bamposo 7 to ya banduku ya kusansa sambu na kuzaba bansoba yina lenda salama na kisika ya redox ya cytoplasme na nima ya kuzikisa mambu ya FLIM (Kifwanisu S8, E tii na G). Kufiongunina monisaka kukula ya nene na kifulu ya oxidation ya PN mosi ya Mfn2cKO yina kele na PCx ve, yina me swaswana ti ba neurones ya kulandila to ba PN ya Mfn2cKO yina ke monisa kaka shRNA ya kukangama (Kifwanisu 5, D na E). Ntangu bo vandaka kukulumusa nsiku ya PCx, ntalu ya ba PN ya Mfn2cKO yina vandaka kumonisa kikalulu ya kukonda oxidation mingi kumaka mingi kuluta mbala tatu (Kifwanisu 5E), yo ke monisa nde nsiku ya PCx vandaka kutanina ngolo ya redox ya ba neurone yina me beba.
(A) Mutindu mosi ya ke monisa manaka ya kumeka sambu na kutula AAV yina ke pesa code shPCx ntangu nzila ya metabolique yina bo me monisa ke sala. (B) Bafoto ya ke monisa bitini ya butomfu ya ntu ya bamposo 8 na bampuku ya Mfn2cKO yina bo me balula mpi me tula bidimbu ti bima yina ke nwanaka ti maladi ya ntu na bamposo 4. Barre ya nene, 450m. (C) Kutanga ntalu ya baselile ya Purkinje na ba nzila ya bo me balula na AAV (kufimpa ya nzila mosi ya kuswaswana; n = 3 tii na 4 ya ba nsusu). Ba nsangu ke monisama na mutindu ya mwayene±SEM; ***P<0,001. (D) Kifwanisu ya FLIM ya ke monisa ke monisa luzingu ya mwayene ya PN ya bamposo 7 yina ke monisaka Grx1-roGFP2 yina ke pesaka ngolo na nitu na nsi ya mambu yina bo me tubila sambu na kumeka. LUT (mesa ya kutala) ntalu: ntangu ya kuguluka (na basegonde). Barre ya nene, 25m. (E) Kifwanisu ke monisa kukabula ya ntalu ya luzingu ya Grx1-roGFP2 banda na (D) (n=158 tii na baselile 368 na bampuku zole na nsi ya konso kikalulu). Tablo ya zulu ya konso histogramme: ke monisa ntalu ya ba cellule yina kele na ba ntalu ya luzingu ya nda mingi (ya mbwaki, ya kukangama) to ya nkufi (ya mbwaki, ya kukulumuka), yina ke luta 1 SD ya ntalu ya luzingu ya mwayene na CTRL-AAV-scr. (F) Mutindu yina bo me pesa ke monisa bupusi ya lutaninu ya PCx ya misisa ya butomfu.
Na kimvuka, bansangu ya beto kepesa awa kemonisa nde kumonisa dyaka MFN2 lenda gulusa mpenza PN ya kuyela ti kifu ya ngolo ya OXPHOS, kukonda ngolo ya ADN ya mtDNA, mpi kimuntu ya mbi kibeni ya kele bonso ista, ebuna yo lenda pesa kuyela ya kelanda ata na bimbefo ya kuyela. Kubeba ya butomfu kepesaka nzikisa ya kevutukilaka mambu yina kusalamaka na ntwala nde baselile kufwa. Kitezo yayi ya kusoba ya mvingu ya bantu ke monisama diaka na ngolo ya ba neurones ya kupesa nzila na kubebisa misisa (kuvutula nzila ya nzila ya TCA), yina ke kangaka nzila na PCx na ba PN yina ke konda OXPHOS mpe ke kumisaka ngolo lufwa ya baselile, na mutindu yina yau ke salaka kisalu ya kutanina (Kifwanisu 5F).
Na kulonguka yai, beto pesaka banzikisa nde mvutu ya ba PN na kukonda kusala mbote ya OXPHOS kele ya kuvukana malembe-malembe ti maladi ya ntu ya TCA na nzila ya nzila ya kupesa ngolo ya kuswaswana yina ke salamaka na nzila ya baprograme ya metabolike. Beto ndimisaka analize ya proteomique ti bametode mingi ya kuyidika mpi monisaka nde kana bo me tula ntembe na maladi ya ngolo ya mitokondrie, baselile ya butomfu ke vandaka ti mutindu mosi ya kukangama yina bo zabaka ve ntete. Na kuyituka na beto, mutindu yonso ya kuvutula bansinga ketulaka ve kidimbu ya kikalulu ya nsuka ya metabolism yina kekwendaka nzila mosi ti kubeba ya butomfu malembe-malembe mpi na mutindu mosi ya lenda vutuka ve, kansi bansangu na beto kemonisa nde yo lenda vanda butomfu mosi ya ketaninaka ata na ntwala ya lufwa ya baselile Mecanisme ya kufuta mbongo. Mambu yai ya bo me mona ke monisa nde ba neurone ke vandaka ti ngolo mingi ya kusoba bima na nitu. Dyambu yai kemonisa nde kukotisa dyaka MFN2 na nima lenda balula mutindu ya kumonisa bidimbu ya mfunu ya metabolike mpi kukanga nzila na kubeba ya PN. Kansi, yo ke kangaka maladi ya misisa mpi ke salaka nde misisa kusala nswalu. bantu yina ke vukisaka nitu ti babakala.
Mosi ya mambu ya kuluta kitoko yina beto me mona na bansosa na beto kele nde ba PN yina ke vandaka ve ti OXPHOS lenda soba mutindu nitu ke balulaka nitu na TCA na nzila ya ba enzyme yina ke twadisaka mbote-mbote maladi ya misisa. Kuyidika diaka bima ya nitu kele kikalulu ya ke monanaka mingi na baselile ya kansere, yina ya nkaka ke tulaka ntima na glutamine sambu na kuyika bima ya kati-kati ya nzietelo ya TCA sambu na kubasisa bima yina ke kulumusaka ntalu ya nitu, yina ke pusaka nzila ya kupema mpi ke taninaka kubasisa bima yina ke sadisaka nitu na kusala mafuta mpi bima ya nkaka ( 39 , 40 ). Kulonguka mosi ya ntama mingi ve monisaka nde na ba tissus périphériques yina ke kutanaka ti mpasi ya OXPHOS, kuvutukila kukangama ya mvingu ya bantu kele mpi kikalulu mosi ya mfunu (5, 41), kisika nzila ya kukota ya mvingu ya bantu na kati ya nzietelo ya TCA ke tadila Sambu na mpasi ya mputa ya OXPHOS (41). ). Kansi, nzikisa ya pwelele kele ve na yina metala konso kuwakana yina kele na kati ya ba plastique ya metabolisme ya ba neurone na nitu mpi mfunu na yo yina lenda vanda na mambu ya metala kimbefo. Na kulonguka mosi ya ntama mingi ve ya bo salaka na vitro, bo monisaka nde baselile ya ntete ya nitu ke vukisaka bamasa ya glutamate sambu na kupesa bansangu na misisa, ebuna yo ke sadisaka na kubasisa bima yina ke pesaka ngolo na nitu mpi na kubebisa misisa ya nitu na nsi ya bampasi ya nitu ( 42 ). Yau kele mfunu na kuzaba nde na nsi ya kubuyisa ya kimunganga ya enzyme ya nzietelo ya TCA, bo kekwikilaka nde kukangama ya pyruvate ketaninaka kimvuka ya oxaloacétate na ba neurone ya mbuma ya ntu yina bo meyedisaka ( 34 ). Kansi, mfunu ya fiziolozi ya bima yai sambu na misisa ya butomfu (kisika bo ke yindulaka nde maladi ya misisa ya butomfu ke vandaka mingi-mingi na ba astrocyte) kele kaka ti mfunu ya mfunu ya fiziolozi (43). Na mutindu yina, bansangu na beto ke monisa nde ba PN yina me beba na OXPHOS na nitu lenda baluka na kubeba ya BCAA mpi na kubebisa pyruvate, yina kele bisika zole ya nene ya kuyika bima ya kati-kati ya masa ya TCA. Ata bo me tubaka nde bo ke yindulaka nde BCAA ke sadisaka na kuyidika ngolo ya misisa ya butomfu, katula kisalu ya glutamate mpi ya GABA sambu na kupesa ngolo na misisa ya butomfu ( 44 ), ata nzikisa mosi ve ke monisa nde mambu yai ke salamaka na luzingu. Na yina, yau kele pete na kuyindula ti ba PN yina ke salaka ve lenda futa na mbala mosi kudya ya bima ya kati-kati ya TCA yina ke nataka na nsadisa ya nzila ya kuvukisa na kukumisaka ngolo kimbefo ya misisa. Na kutuba ya mbote, yo lenda lomba nde bo tula PCx na zulu sambu na kutanina mpusa ya mingi ya aside aspartique, yina bo me monisaka na baselile yina ke kumaka mingi yina kele ti maladi ya mitokondrie ( 45 ). Na nima, yandi monisaka ve nde ata nsoba mosi ya nene me salama na kiteso ya kukonda kusoba ya aside aspartique na ba PN ya Mfn2cKO (Kifwanisu S6A), yina ke monisa mutindu ya kuswaswana yina bo ke sadilaka aside aspartique na kati ya baselile yina ke yela mpi baselile yina ke kumaka mingi na nima ya mitose . Ata mutindu ya sikisiki ya kuyidika PCx na ba neurone yina ke salaka ve mbote na in vivo me bikala sambu na kuzaba, beto monisaka nde mvutu yai ya nswalu ke salaka kisalu ya mfunu sambu na kutanina kikalulu ya redox ya ba neurone, yina bo monisaka na ba eksperiansi ya FLIM na bitini ya butomfu ya ntu. Mingimingi, kukanga ba PN nzila ya kuyidika PCx lenda nata kikalulu ya oxidation mingi mpi kufwa nswalu ya baselile. Kusala nde BCAA kubeba mpi kusala nde pyruvate kukuma ngolo kele ve mitindu ya kumonisa mutindu misisa ya nziunga ke salaka ve mbote (7). Yo yina, yo ke monana nde yo kele kikalulu ya ntete ya ba neurone yina ke vandaka ve ti OXPHOS, ata yo kele ve kikalulu mosi mpamba, yina kele mfunu sambu na kubeba ya misisa ya butomfu. .
Kimbefo ya ntu kele mutindu ya kimbefo ya ke fwaka misisa ya ntu yina ke monanaka mbala mingi na mutindu ya ataxie mpi mbala mingi yo ke bebisaka ba PN (46). Kimvuka yai ya ba neurone kele na kigonsa ya nene ya kukonda kusala mbote ya mitokondrie sambu kubeba na bo ya kupona na bampuku mefwana sambu na kubuta bidimbu mingi ya nitu yina kemonisaka ataxie ya ntu ya muntu ( 16 , 47 , 48 ). Na kutadila bansangu, mbandu ya mputa mosi ya bo me balula na nitu yina kele ti gène yina ke sobaka ke vandaka na kuwakana ti ataxie ya ntu ya muntu mpi yo kele ti maladi ya ntu (49, 50), yo ke monisa mfunu ya kulonguka malanda ya kukonda OXPHOS na PNPH. Yo yina, yo mefwana mpenza na kukatula mpi kulonguka mbote-mbote kimvuka yai ya ba neurone ya kuswaswana. Kansi, sambu ba PN kewaka mpasi mingi na bupusi mpi yo kepesaka kitini ya fyoti ya baselile yonso ya butomfu ya ntu, sambu na bansosa mingi ya mesimbama na omics, kukabula yo na mutindu ya kupona bonso baselile ya mvimba kele kaka dyambu mosi ya mpasi. Ata yau kele penepene na kusalama ve na kukonda mpenza mvindu ya mitindu yankaka ya baselile (mingimingi baselile ya bambuta), beto vukisaka kitambi mosi ya mbote ya kukabula ti FACS sambu na kubaka ntalu ya kufwana ya baselile ya butomfu yina lenda zinga sambu na kusala analize ya proteomique ya kelanda, mpi kuvanda ti baproteine ​​mingi kibeni (kiteso ya 3000 ya baproteine ​​ya bo metulaka na zulu ya baproteine ​​yina kele ti baproteine ​​yina kefwanisaka (51). Na kutaninaka luzingu ya baselile ya mvimba, metode ya beto kepesa awa kepesaka beto nzila kaka ve ya kutala bansoba yina kesalamaka na nzila ya bima yina kevandaka na kati ya mitokondrie, kansi mpi na kutala bansoba yina kesalamaka na bampangi na yo ya baselile, yina kesadisaka na kusadila nsinga ya mitokondrie yina kele ti bidimbu ya sikisiki sambu na mitindu ya baselile ya mpa. (52, 53). Metode ya beto ketendula ketadila kaka ve kulonguka ya baselile ya Purkinje, kansi yo lenda salama kukonda mpasi na konso mutindu ya baselile sambu na kutadila bansoba yina kesalamaka na butomfu yina kebelaka, ata mpi mitindu yankaka ya kukonda kusala mbote ya mitokondrie.
Na nsuka, beto me zaba fenetre mosi ya kusansa na nsungi ya kisalu yai ya kuyidika diaka bima yina kele na nitu yina lenda balula kibeni bidimbu ya mfunu ya mpasi ya baselile mpi kubuyisa kubeba ya misisa ya butomfu. Na yau, kubakisa mambu yina kesalamaka na kisalu ya kuvutula bansinga yina bo metendula awa lenda pesa mayele ya mfunu na yina metala bankisi yina lenda sadisa na kutanina luzingu ya misisa ya butomfu na ntangu misisa ya butomfu kesala ve mbote. Yo kelomba kusala bansosa na bilumbu kekwisa yina kele ti lukanu ya kuzaba bansoba yina kesalamaka na mutindu baselile yankaka ya butomfu kebalulaka ngolo sambu na kuzaba mbotembote mutindu munsiku yai lenda salama na bimbefo yankaka ya butomfu.
Bau metubilaka ntete bampuku ya MitoPark (31). Ba nsusu ya C57BL/6N yina kele na loxP yina kele na lweka ya ba gènes ya Mfn2 me tubilamaka ntete (18) mpe ba me vukisa yau na ba nsusu ya L7-Cre (23). Na nima, bo vukisaka bana zole yina basikaka ti bampuku yina vandaka ti bampuku ya mutindu mosi sambu na kubasisa ba gène ya Purkinje yina bo ke bingaka knockout ya gène sambu na Mfn2 (L7-cre). Na kati ya kimvuka mosi ya fioti ya kuvukisa nitu, bo kotisaka allele ya Gt (ROSA26) na nzila ya ba kulunsi ya nkaka (20). Ba nzila nyonso ya kusadila ba mbisi salamaka na kulandaka bantuma ya Eropa, ya insi mpe ya ba inzo ya bisalu mpe yau ndimamaka na kimvuka ya luyalu ya Umwelt mpe ya Verbraucherschutz, na Rhénanie du Nord-Westphalie, na Allemagne. Kisalu ya bibulu ke landaka mpi lutwadisu ya kimvuka ya Eropa ya ke talaka mambu ya bibulu ya laboratoire.
Na nima ya kutula anesthesie na kisika yina divumu me katuka, bo ke katulaka divumu ya mpuku (E13). Bau zengaka mpusu ya nitu na nsadisa ya masa ya mungwa ya Hanks (HBSS) yina bo yikaka ti Hepes 10 mM mpi bo lutisaka yo na nsadisa ya masa ya Dulbecco yina bo me sobaka na masa ya ke vandaka ti papaine (20 U/ml) mpi cystéine (1μg/ml). Kukanga mukanda na DMEM) mpi kukabula yo na nzila ya enzyme. Ml) na 37°C na nsungi ya miniti 20, na nima bo ke nikisa yo na nzila ya masini na DMEM yina bo me yika 10% ya menga ya ngombe yina kele na divumu. Bau kunaka baselile na ba nsinga ya kufika ya ditensi yina ba me pakula na polylysine na kitezo ya 2×106 na dilonga ya kukuna ya 6 cm to na kitezo ya 0,5×105 ya baselile/cm2 samu na kufiongunina bifwanisu. Na nima ya bangunga 4, bo yingisaka nkisi yina ti nkisi yina kele ve ti menga ya Neurobasal yina kele ti 1% ya B27 mpi 0,5 mM ya GlutaMax. Na nima, bo vandaka kutanina ba neurone na 37°C mpi na 5% ya CO2 na nsungi yonso ya kumeka, mpi bo vandaka kudisa yo mbala mosi na mposo. Samu na ku pesa nzila na ku vukisa diaka na kati ya bima ya mvingu ya bantu, ba sadilaka 3 μl (dilonga ya kukuna ya 24-point) to 0,5 μl (plaque ya 24-point) ya vecteur ya virisi AAV9 yayi samu na kusansa ba neurones na kilumbu ya zole na kati ya bima ya mvingu ya bantu: AAV9.CMV.PI.eGFP. 105530-AAV9) mpi AAV9.
23212 mpe #23213, na kulandana) ke tula kidimbu na ndonga ya V5 (GKPIPNPLLGLDST) na nsuka ya C, mpe ke vukana na mCherry na kadre na nzila ya ndonga ya T2A. Grx1-roGFP2 kele dikabu ya me katuka na TP Dick DFKZ. Na kuyingisaka kaseti ya tdTomate na kusadilaka mitindu ya ntama ya kusala clonage, bo salaka clonage ya kaseti yina na kati ya mukongo ya pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nimero ya referansi ya Addgene 28306) sambu na kubasisa pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-V5. Ba vecteur ya FLEX-mCerise-T2A-MFN1-V5 mpi ya pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Bau sadilaka mayele ya mutindu mosi sambu na kubasisa vecteur ya kulandila pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Sambu na kutunga AAV-shPCx, yo kelombaka vecteur ya plasmide AAV (VecteurBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), yina kele ti ndonga ya ADN yina ketulaka bakode na PCx ya mpuku yina ketubilaka shRNA (5′ 3′) Na nsi ya luyalu ya ntuadisi ya U6, mCherry ke sadilamaka na nsi ya ntuadisi ya ntuadisi ya CMV. Kusala ba vecteur ya AAV ya nsadisa salamaka na kutadila bantuma ya muntu yina salaka yo (Biolabs ya baselile). Na bunkufi, sadila plasmide mosi ya ke nataka mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (mCherry-T2A-MFN1-V5) sambu na mwa ntangu fioti Kubalula ya 2000 cellule 2019 mFAV2 10:10, 11. 10 Kukangama na plasmide ya plasmide, na kusadilaka metode ya fosfate ya calcium. Bau bakaka masa ya virisi ya mvindu na nzila ya ba cycle ya congélation-dégel na kati ya masa ya kuyobila ya kuyuma ya glace/éthanol mpe bau me katula baselile na masa ya mungwa ya bo me vukisa ti phosphate (PBS). Bau sukulaka vecteur ya AAV na nzila ya kuyoka ya kukonda kulandana (bangunga 24 na 32 000 rpm na 4°C) mpe bau vukisaka yau na kusadilaka filtre ya kuyoka ya Amicon. 2,9×1013 kopi ya génome (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCerise (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX ya bo me sonikaka na ntalu ya kieleka (ntangu ya kieleka ya PCR), bo tesaka yo mutindu bo tesaka yo na ntwala. (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) mpi 8,9×1012 GC/ml.
Bau katulaka ba neurones ya ntete na PBS 1x ya madidi bonso glace, bau salaka yau na ba mbuma, mpe na manima bau vukisaka yau na kati ya tampon ya lyse ya 0,5% ya Triton X-100 / 0,5% ya tampon ya lyse ya PBS yina kele na fosfatase mpe inhibiteur ya protease (Roche). Bau salaka kuzaba ntalu ya ba proteine ​​na kusadilaka test ya aside bicinchonique ( Na nima, bo kabulaka baproteine ​​yina na nzila ya électrophorèse ya gel ya SDS, mpi na nima bo tulaka yo na zulu ya kima mosi (GE Healthcare). Kukanga bisika yina kele ve ya sikisiki mpe kukanga na ntuala ya ntete (tala Tableau S1 samu na kuzaba mambu mingi) na 5% ya miliki na TBST (Saline tamponné par Tris avec Tween), ba nzila ya kuyobisa mpe ntungulu ya zole na TBST Kukanga. Kukangama na ba anticorps ya ntete na mpimpa ya mvimba na +4°C. Na nima ya kuyobisa, tula anticorps ya zole na bangunga 2 na tiya ya kisika yina nge ke vandaka. Na nima, na kutulaka nsinga ya mutindu mosi ti kima mosi ya ke nwanaka ti β-actine, bo ndimisaka nde yo vandaka ti kizitu ya mutindu mosi. Kuzaba na kubalulaka na kimunganga mpi kutomisa kimunganga (GE Healthcare).
Ba neurones yina bo vandaka kukuna ntete na zulu ya bima ya kufika ya ditensi, bo vandaka kukanga yo ti 4% ya paraformaldehyde (PFA)/PBS na ntangu yina bo me tubila na tiya ya nzo na nsungi ya miniti 10. Bau ketulaka ntete na kati ya bima yina kefikaka 0,1% ya Triton X-100/PBS na nsungi ya miniti 5 na tiya ya nzo, na nima na kati ya tampon ya kukanga [3% ya menga ya bangombe (BSA)/PBS]. Na kilumbu ya zole, bo yobisaka bima yina bo vandaka kufika ti tampon ya kukanga mpi bo tulaka yo na kati ya bima yina vandaka kukanga nitu na nsungi ya bangunga 2 na tiya ya nzo; na nsuka, bo sukulaka mbote-mbote ba échantillons na PBS ti 4′,6-diamidino-2 -Phénilindole (DAPI) yina bo ke tulaka mukubu ya nkaka mpi na nima bo ke kangaka yo na zulu ya diapozitive ya mikroskope ti Aqua-Poly/Mount.
Ba nsusu (bakala na nketo) ba tulaka bau na kivumu na nzila ya kutula bau na kati ya kivumu mpe bau tulaka bau na nsi ya mpusu ya nzutu na nkisi ya kumanisa mpasi (5 mg/kg) , Mpe bau tulaka bau na kati ya kisadilu ya kukangama (Kopd a) yina kele na kisadilu ya mvita. Kangula ntu ya ntu mpi sadila forage ya meno sambu na kufiotuna kitini ya ntu ya ntu yina ke wakana ti mukwa ya mis (katuka na lambda: mukila 1,8, 1 ya lweka, yina ke wakana ti ba lobule IV mpi V). Sadila ntunga ya seringe ya kukangama sambu na kusala na dikebi yonso dibulu ya fyoti na kati ya ntu sambu na kubebisa ve misisa yina kele na nsi. Na nima, bo ke kotisaka malembe-malembe nsinga ya ditensi ya fioti yina bo me benda na kati ya dibulu ya fioti (banda na -1,3 tii na -1 na ndambu ya divumu ya dura mater), mpi bo ke kotisaka 200 tii na 300 nl ya AAV na kati ya nsinga ya fioti (Narishige) ti ba seringue ya maboko (Narishige) na nsungi ya pression ya fioti tii na 1000. fenetre ya miniti. Na nima ya kutula menga, tula kapilere na miniti 10 ya nkaka sambu virisi kumwangana mvimba. Na nima ya kukatula misisa ya menga, bo ke tungaka mpusu ya nitu mbote-mbote sambu na kukulumusa mvimbu ya mputa mpi kupesa mbisi nzila ya kubeluka. Bau vandaka kupesa bambisi yina bankisi ya ke lembikaka mpasi (caspofen) bilumbu mingi na nima ya kusala bau operasio, na ntangu yina bau vandaka kutala mbote-mbote mutindu nitu na bau vandaka mpi na nima bau vandaka kufwa bau na ntangu yina bau tubilaka. Bau salaka ba nzila nyonso na kulandaka bantuma ya Eropa, ya insi mpe ya bimvuka mpe yau ndimamaka na kimvuka ya luyalu ya Umwelt mpe ya luyalu ya Rhénanie du Nord-Westphalie, na Allemagne.
Bau tulaka bambisi na ntuala ya nkisi ya kukangama (100 mg/kg) mpe ya xylazine (10 mg/kg), mpe bau tulaka ntete PBS 0,1 M na ntima, mpe na manima 4% ya PFA na kati ya PBS. Bau ke zengaka mukanda ya nitu mpe ke kangaka yau na kati ya 4% ya PFA/PBS na mpimpa ya mvimba na 4°C. Bau sadilaka munduki mosi ya ke nikisa (Leica Microsystems GmbH, Vienne, Autriche) sambu na kuyidika bitini ya butomfu ya ntu (nene ya 50 μm) ya butomfu ya kukangama na PBS. Katula kaka kana bo me songa mutindu ya nkaka, bo vandaka kutula mukubu na bitini yina ke tambulaka na masa mutindu beto me tubila yo na zulu (13) na tiya ya nzo mpi na kunikisa yo. Na bunkufi, ntete, bo tulaka bitini yina bo bakaka na masa na nsungi ya miniti 15 na tiya ya nzo; sambu na ba epitope ya nkaka (Pcx na Shmt2), na nzila ya tampon tris-EDTA na 80°C (PH 9) tula ba nsinga ya tiya na nsungi ya miniti 25 na kifulu ya kusala mambu yai. Na nima, bo tulaka bitini yina ti bima ya ntete ya ke taninaka nitu (tala Tableau S1) na kati ya tampon ya kukanga (3% BSA/PBS) na 4°C na mpimpa ya mvimba ti kunikisa. Na kilumbu yina landaka, bo yobisaka bitini yina ti tampon ya kukanga mpi bo tulaka yo na kati ya ntunga ya zole yina me fwana yina bo me vukisa ti fluorophore na nsungi ya bangunga 2 na tiya ya nzo; na nsuka, bo vandaka kuyobisa bitini yina mbote-mbote na PBS, bo vandaka kutula yo mukubu ya nkaka ti DAPI, mpi na nima bo vandaka kukanga yo ti AquaPolymount Na zulu ya diapositive ya mikroskope.
Bau sadilaka mikroskope mosi ya ke talaka na nzila ya laser (TCS SP8-X to TCS Feuille de lumière numérique, Microsystèmes de Leica) yina kele ti nsemo ya mpembe mpi nsemo ya 405 ya diode sambu na kubaka bifwanisu ya bima yina bo bakaka. Na kupesaka kiese na fluorophore mpi na kuvukisaka kidimbu ti Detecteur Hybride (HyDs), bo sadilaka logiciel LAS-X sambu na kuvukisa bifwanisu yina bo me tula na zulu ya bifwanisu yina ke wakana ti mutindu ya kubaka bifwanisu ya Nyquist na mutindu ya kulandana: sambu na bapanneau yina kele ve ya ntalu, yo kele bidimbu ya ngolo mingi (mu mbandu, na baselile ya nitu mpi na ba dendrite) mt MutinduR ya kusema). Kukangama ya 0,3 tii na 6 ns ke salama sambu na kukulumusa fondasio.
Kubaka bifwanisu na ntangu ya kyeleka ya baselile ya bo meponaka. Na nima ya kupona na kati ya ntoto yina kele ti 1% ya B27 mpi 0,5 mM ya GlutaMax, bo kunaka mbala mosi baselile na zulu ya ba diapositive ya bo me pakula ti poly-l-lysine ( sambu na kuzinga. Bau salaka bifwanisu na ntangu ya kyeleka na nzila ya mikroskope mosi ya Leica SP8 yina kele ti laser ya mpembe, HyD, ya kele ti mafuta ya 63×[1,4 ouverture numérique) mpi kisika ya kuyoka tiya.
Bau tulaka nsusu nswalu anesthésie na dioxyde de carbone mpe bau zengaka ntu, bau katulaka nswalu butomfu na ntu, mpe bau zengaka yau na kitini ya sagittal ya nene 200μm (sambu na kumeka kutula bidimbu na 13C) to 275μm (sambu na kumeka bafoton zole) ya kufuluka na bima yai ya crece (VH-M i6). 125 mM ya madidi bonso glace, ya kufuluka ti carbone (95% ya O2 mpi 5% ya CO2) ya Ca2 fioti + masa ya bo me sala na butomfu (ACSF) NaCl, 2,5 mM ya KCl, 1,25 mM ya buffer ya sodium, m2 ya sodium. sukadi, 0,5 mM ya CaCl2 mpi 3,5 mM ya MgCl2 (presion ya osmotique ya 310 tii na 330 mmol). Kupesa bitini ya butomfu yina bo me baka na kisika yina bo ke tulaka bima na ntwala ya kukangama yina kele ti Ca2 + ACSF mingi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, tampon ya phosphate de sodium 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, Ca MgCl2) Na kati-kati) pH 7,4 na 310 tii na 320 mmol).
Na ntangu bo vandaka kusala bifwanisu, bo vandaka kunata bitini yina na suku mosi ya bo me yidikaka sambu na bifwanisu, mpi bo vandaka kusala eksperiansi yina na nsi ya ACSF yina bo vandaka kutula yo ntangu yonso na tiya ya 32° tii na 33°C. Bau sadilaka mikroskope mosi ya ke talaka bafoto mingi (TCS SP8 MP-OPO, Microsystems Leica) yina kele ti kima mosi ya ke sadisaka na kumona bifwanisu (NA 0,95, masa), laser ya Ti: Safire (Vision du Caméléon II, Cohérent) sambu na kubaka bifwanisu ya bitini. Module ya FLIM (Kifwanisu ya Kifwanisu, Kifwanisu ya Kifwanisu).
FLIM ya Grx1-RoGFP2. Ba nsobolo ya kikalulu ya rédox ya ba PN me tesama na nzila ya FLIM ya ba foto zole na bitini ya butomfu ya ntu, kisika yina biocapteur Grx1-roGFP2 vandaka kutadila ba PN. Na kati ya nsinga ya PN, bo ke ponaka kisika ya kubaka bima kiteso ya 50 tii na 80 μm na nsi ya kisika ya bo me zenga sambu na kuzikisa nde kele ti PN yina ke zingaka (disongidila, kukonda ngidika ya bima ya bo me sala ti bambuma to bansoba ya mutindu ya misisa ya butomfu na nzila ya ba dendrite) mpi bima zole ya ke sadisaka na kuzaba mambu yina ke salamaka na nitu ( roGFP2 ). mCerise). Kuvukisa bifwanisu ya kimvuka mosi ti zoom ya 2x [nda ya onda ya kupesa kikesa: 890 nm; 512 nm 512 ya bifwanisu]. Kuzaba: HyD ya kati, kimvuka ya filtre ya FITC] mpe kusala mwayene ya bifwanisu na kati ya ba miniti 2 ti 3 ke sadilamaka samu na kuzaba kana ba foton ya kufwana me vukana (ba foton 1000 na kimvuka) samu na kufwanana na ba nzila ya kukangama. mM ya H2O2 ya exogène na ACSF yina bo ke tulaka na menga (sambu na kukumisa ngolo de oxidation, yina ke salaka nde luzingu kukuma mingi), mpi na nima kuyika mM ya luzingu ya roGFP2. kukulumusa, yina ke sala ti luzingu ya muntu kukulumuka) (Kifwanisu S8, D tii na G). Sadila logiciel FLIMfit 5.1.1 sambu na kutadila bamvutu yina bo me baka, kufwanana ti curve ya kubeba ya kifwanisu ya mvimba na IRF yina bo me tesaka (kisalu ya mvutu ya bisadilu), mpi χ2 kele kiteso ya 1. bo ke sadilaka yo sambu na kuzaba ntalu ya bima.
Kufimpa ngolo ya mitokondrie. Na nima ya kutula kitini ya ngolo na kati ya TMRM 100 nM yina bo yikaka mbala mosi na ACSF yina bo me tula menga na nsungi ya miniti 30, bo tesaka bansoba ya ngolo ya mitokondrie ya ba PN na nsadisa ya mikroskope ya bafoto zole. Bau salaka bifwanisu ya TMRM na kupesaka kikesa na sonde na 920 nm mpi na kusadilaka HyD ya kati (isothiocyanate de tétraméthylrodamine: 585/40 nm) sambu na kuvukisa bidimbu; na kusadilaka mutindu mosi ya kupesa kikesa kansi na kusadilaka HyD ya kati ya kuswaswana (FITC :525/50) sambu na kufwanisa mtYFP. Sadila kima ya ke sadisaka na kuzaba bifwanisu ya ImageJ sambu na kutadila ngolo ya mitokondrie na nivo ya selile mosi. Na bunkufi, bo ke sadilaka ekwasio ya kukangama: kidimbu = min (mtYFP, TMRM) sambu na kuzaba kisika ya mitokondrie yina ke monisaka kidimbu ya TMRM na ndinga ya Purkinje na kifwanisu ya ke vukisaka nzila mosi ya nzila yina ke wakana. Na nima, bo ketangaka kisika ya bapixel na kati ya maske yina kebasikaka, mpi na nima bo ketulaka yo na kifwanisu ya mtYFP yina kewakana ti yo sambu na kubaka kitini ya mitokondrie yina kemonisaka ngolo ya mitokondrie.
Bo katulaka kifwanisu yina na nsadisa ya logiciel mosi (Huygens Pro). Sambu na bifwanisu ya bo me scanner ya ba carreaux, bo ke salaka montage ya carreaux mosi na kusadilaka logiciel LAS-X yina ke salaka bifwanisu ya kutunga na mutindu mosi ya kukonda kuyindula. Na nima ya kutula kifwanisu na ndonga, sadila ImageJ mpi Adobe Photoshop sambu na kuyidika diaka kifwanisu mpi kuyidika mutindu mosi nsemo mpi luswaswanu. Sadila Adobe sambu na kuyidika bifwanisu.
mtADN ya kutula dikebi. Bo tangaka ntalu ya bamputa ya mtDNA na bitini ya butomfu ya ntu yina bo sonikaka ti bima yina ke taninaka ADN na nzila ya mikroskope yina ke talaka mambu yonso. Bo salaka konso kisika yina bo vandaka kusosa sambu na nitu ya selile mpi sambu na ntu ya konso selile, mpi bo tangaka kisika yina na kusadilaka logiciel ImageJ (Multi Mesure). Katula kisika ya nikleyere na kisika ya nitu ya selile sambu na kubaka kisika ya cytoplasme. Na nsuka, bo sadilaka plug-in ya bo ke bingaka Analyser des particules (logiciel ImageJ) sambu na kuzaba na mbala mosi ntalu ya bapoint ya ADN ya ke monisa mtDNA na kifwanisu ya nsuka, mpi bo yidikaka bamvutu yina bo bakaka na mwayene ya PN ya bampuku ya CTRL. Bo ke monisaka mambu yina bo ke bakaka bonso ntalu ya mwayene ya ba nucléoside na konso selile.
Kufimpa mutindu proteine ​​ke basikaka. Sadila nzila ya ImageJ sambu na kutadila mutindu baproteine ​​ke basikaka na PN na nivo ya selile mosi. Na bunkufi, na kifwanisu ya ntu-dyambu mosi ya nzila yina kewakana ti yo, na nzila ya ekwasio: kidimbu = min (mtYFP, ntungulu), bo kezabaka kisika ya mitokondrie yina kemonisaka ngolo ya ntungulu mosi buna na Purkina. Na nima, bo ke tangaka kisika ya bapixel na kati ya maske yina bo me basisa, mpi na nima bo ke yidikaka yo na kifwanisu ya mtYFP yina ke wakana ti yo sambu na kubaka kitini ya mitokondrie ya proteine ​​yina bo ke monisaka.
Kufimpa ntalu ya baselile ya Purkinje. Bau sadilaka plugin ya ImageJ sambu na kutadila ntalu ya baselile ya Purkinje na kukabisaka ntalu ya baselile ya Purkinje yina bo tangaka na nda ya nsinga ya butomfu ya ntu yina baselile yina bo tangaka vandaka kubaka.
Kubongisa mpi kubaka bambandu. Bau kangaka butomfu ya kimvuka ya luyalu mpe ya ba nsusu ya Mfn2cKO na 2% ya PFA/2,5% ya glutaraldehyde na kati ya 0,1 M ya tampon ya phosphate (PB), mpe na manima bau yidikaka bitini ya ntu na kusadilaka ba ciliate (Tampon ya nene 50 tii na PBn 600). 1,5% ya ferrocyanure ya potassium na tiya ya nzo na ngunga 1. Bau sukulaka bitini yina mbala tatu na masa ya kuyoka, na nima bau tulaka yau mukubu na 70% ya éthanol yina kele na 1% ya uranyl na nsungi ya miniti 20. Na nima, bo katulaka masa na bitini yina na malafu ya bo me tula na ndonga mpi bo tulaka yo na kati ya ba diapositive ya ditensi yina bo me pakula silicium, mpi nsuka-nsuka na 60°C bo salaka yo na furu. Bau ponaka kisika ya ntu ya ntu mpi bau zengaka bitini ya fioti kibeni ya 50 nm na nzila ya kisadilu mosi ya bo ke bingaka Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Autriche) mpi bau bakaka yau na zulu ya grille ya 2×1 mm ya cuivre yina bo me pakula filme ya polystyrène. Bau tulaka ba ndambu yina mukubu na masa ya 4% ya uranyl na masa na miniti kumi, bau sukulaka yau na masa mbala mingi, na nima bau sukulaka yau na citrate ya plomb ya Reynolds na masa na nsungi ya miniti kumi, na nima bau sukulaka yau na masa mbala mingi. Bo bakaka bafoto ya fioti-fioti ti mikroskope mosi ya bo ke bingaka Philips CM100 ( Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis ) na nsadisa ya kamera mosi ya bo ke bingaka TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, États-Unis). Allemagne).
Sambu na bampuku yina vandaka ti AAV, bo kabulaka butomfu mpi bo zengaka yo na kitini ya ntu yina vandaka ti nene ya 1 mm, mpi bo tadilaka butomfu ya fioti na nsadisa ya mikroskope yina ke pesaka nsemo sambu na kuzaba kisika yina bo me bebisa AAV (disongidila, mCherry yina ke basisaka). Bo kesadilaka kaka ba eksperiansi yina bo ketulaka AAV sambu na kubasisa ngolo mingi kibeni ya couche ya baselile ya Purkinje (disongidila penepene ya couche ya mvimba) ata na ba-anneau zole ya kulandana ya butomfu ya ntu. Bau salaka ba nzila ya fioti-fioti samu na kukangama na mpimpa mosi (4% ya PFA mpe 2,5% ya glutaraldehyde na kati ya tampon ya cacao 0,1 M) mpe bau salaka yau diaka. Samu na kutula EPON, ba sukulaka mukanda ya kukangama na 0,1 M ya tampon ya cacao ya sodium (Applichem), mpe ba tulaka yau na 2% ya OsO4 (os, Bisalu ya siansi; Caco) na 0,1 M ya tampon ya cacao ya sodium (Applichem) Bangunga 4, na manima ba sukulaka yau na bangunga 2. Kuvutukila mbala 3 na tampon ya kokamide 0,1 M. Na nima, bo sadilaka kulandana ya éthanol yina ke tombukaka sambu na kutula konso nkisi ya éthanol na 4°C na nsungi ya miniti 15 sambu na kukatula masa na nitu. Bau tulaka mukanda yina na kati ya oxyde de propylène mpe bau tulaka yau na mpimpa ya mvimba na kati ya EPON (Sigma-Aldrich) na 4°C. Tula mukanda na EPON ya mpa na tiya ya nzo na bangunga 2, na nima kotisa yau na 62°C na bangunga 72. Sadila ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) mpe nsinga ya diama (Diatome, Biel, Suisse) samu na kuzenga bitini ya fioti mingi ya 70 nm, mpe kutula mukubu na 1,5% ya uranyl na miniti 15 na 37°C, mpe kutula mukubu na solution ya citrate ya plomb na miniti 4. Bau bakaka bafoto yina na nsadisa ya kisadilu mosi ya bo ke bingaka JEM-2100 Plus (JEOL) yina kele ti logiciel ya ke sadisaka na kumona mambu na nzila ya Internet (Gatan). Sambu na kutadila mambu, bo bakaka bafoto ya fioti-fioti yina kele ti bifwanisu ya fioti-fioti yina kele ti bifwanisu ya 5000× to 10 000×.
Kutadila mutindu mitokondrie ke vandaka. Sambu na kusala bansosa yonso, bo sonikaka na maboko banzila ya mitokondrie mosi-mosi na bifwanisu ya elektroniki na kusadilaka logiciel ImageJ. Bau ke tadilaka baparametre ya kuswaswana ya nitu. Bau kemonisaka ntalu ya mitokondrie na kati ya nkama yina bo kebakaka na kukabisaka kisika yonso ya mitokondrie ya konso selile ti kisika ya misisa (kisika ya selile = kisika ya selile-kisika ya ntu ya selile) × 100. Bo ketangaka bunene ya mitokondrie na nsadisa ya formule [4π∙2(kisika)]. Bo tadilaka mutindu mitokondrie ke vandaka mpi bo kabulaka yo na bitini zole (“ba-tube” mpi “ba-bubble”) na kutadila mutindu na yo ya nene.
Ntalu ya autofagosome/lysosome mpi kufimpa ntalu ya bima yina ke diaka nitu. Sadila logiciel ImageJ sambu na kusala na maboko banzila ya konso nzila ya konso muntu yina ke diaka bima yina kele na kifwanisu ya elektroniki. Kisika ya autofagosome/lysosome ke monisamaka na ntalu ya bantu yina bo ke tangaka na kukabisaka kisika ya mvimba ya konso selile ti kisika ya selile (kisika ya selile=kisika ya selile-nucleus)×100. Bau ketangaka ntalu ya ba autofagosomes/lysosomes na kukabisaka ntalu ya mvimba na ntalu ya ba ntungulu ya ba autofagosomes/lysosomes na konso selile (na yina metala kisika ya selile) (kisika ya selile = kisika ya selile-kisika ya nikleyere).
Kutula bidimbu sambu na kuzenga bitini ya ngolo mpi kuyidika mbandu. Samu na ba kumeka yina kelombaka kutula bidimbu ya sukadi, nata bitini ya butomfu ya ngolo na kisika ya ntete ya kukangama, yina kele na carbone ya kufuluka (95% ya O2 mpe 5% ya CO2), Ca2 + ACSF ya mingi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, Na3O m2 ya tampon 1,25 mM, phosphate ya sodium 1,25 mM. 25,0 mM ya d-sukadi, 1,0 mM ya CaCl 2 mpe 2,0 mM ya MgCl 2, ya kuyidika na pH 7,4 mpe 310 na 320 mOsm), na kati ya yau sukadi kele 13 C 6- Kuyingisa sukadi (Eurisotop, nimero ya mukanda CLM931). Sambu na kumeka yina kelombaka kutula bidimbu ya pyruvate, tula bitini ya butomfu ya ngolo na Ca2 + ACSF ya kuluta mingi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, tampon ya phosphate de sodium 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, Ca MgCl2, yidika pH 7,4 mpi 310 tii na 320mOsm), mpi yika 1mM ya 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nimero ya mukanda CLM-1082). Tula bitini yina na miniti 90 na 37°C. Na nsuka ya kumeka, bo sukulaka bitini yina nswalu ti masa (pH 7,4) yina vandaka ti 75 mM ya carbonate d’amonium, mpi na nima bo vukisaka yo na 40:40:20 (v:v:v) ya acétonitrile (ACN): méthanol: masa. Na nima ya kutula bitini yina na zulu ya glace na miniti 30, bo tulaka ba échantillons na zulu ya 21 000 g na nsungi ya miniti 10 na 4°C, mpi bo yumisaka masa yina vandaka pwelele na zulu ya glace na kati ya kima mosi ya bo ke bingaka SpeedVac. Bau ke bumbaka mbuma ya kuyuma ya me basika na -80°C tii kuna bau ke sala bansosa.
Kusala bansosa ya masa-masa ya bo me sala ti ba acide aminé 13 ya bo me tula kidimbu ya C. Samu na kufiongunina na nzila ya mvingu ya bantu (LC-MS), ba vutulaka mvingu ya bantu na 75μl ya masa ya mvingu ya bantu (Honeywell). Na nima ya kuyoka na 21 000 g na miniti 5 na 4°C, ba sadilaka 20 μl ya masa yina me katuka na masa yina me katuka na zulu samu na kufiongunina fulu ya ba acide aminé, na ntangu yina ba sadilaka mbala mosi bima yina me bikala samu na kufiongunina ba anion (tala na nsi). Bau salaka kufiongunina ya ba acide aminé na kusadilaka mutindu ya kusadila yina bo tubilaka ntete (55, 56). Na kitini ya ntete, 10μl ya 100 mM ya mvingu ya bantu (Sigma-Aldrich) me yikama na 20μl ya mvingu ya bima ya mvingu ya bantu, na manima 10μl ya 2% ya chlorure de benzoïle (chlorure de benzoïle) me yikama na ACN ya grade LC. Bau ke vutulaka échantillon na zulu ya masa na ntangu fioti mpe na manima bau ke tula yau na zulu ya 21 000 g na miniti 5 na 20°C. Tula masa yina me katuka na zulu ya masa na kati ya dilonga ya 2 ml ya ke bakaka échantillonnage mosi ti kima mosi ya bo me kotisa na ditensi ya kele bonso conique (volume ya 200 μl). Bau fimpaka ba mbandu na kusadilaka ngidika ya LC (Masa) ya ngolo mingi ya Acquity iClass yina me vukana na nzila ya ngidika ya ngolo ya LC (QE)-HF (QE)-HF. Samu na kufiongunina, ba tulaka 2μl ya échantillon dérivé na kati ya 100×1,0 mm ya ngolo mingi ya silice T3 (Masa) yina kele na bima ya 1,8μm. Kutambula ya masa kele 100μl/min, mpe nzila ya kukangama kele na masa A (10 mM ya masa ya ammonium mpe 0,15% ya acide formique na masa) mpe masa B (ACN). Kukwenda na zulu kele mutindu yai: 0%B na miniti 0; 0%B. 0 tii na 15% B na miniti 0 tii na 0,1; 15 tii na 17% B na miniti 0,1 tii na 0,5; B na 17 tii na 55% na miniti 0,5 tii na 14; B na 55 tii na 70% na miniti 14 tii na 14,5; na 14,5 tii na 70 tii na 100% B na miniti 18; 100% B na miniti 18 tii na 19; 100 na 0% B na miniti 19 na 19,1; 0% B na miniti 19,1 tii na 28 (55, 56). 106:10, 11. 106, mpi ntangu ya kuluta mingi ya m/z (ratio ya masa/charge) ya 50 tii na 750. Kisika ya kuyoka masa ya tiya (ESI) ke salaka na ngolo ya kuyoka ya 3,5 kV, tiya ya nzila ya masa ya 250°C, mupepe ya ntu ya 60 AU (ba unités arbitraires), mpi mupepe ya kusadisa ya 20 AU. 250°C. Lentille ya S ke vandaka na 60 AU.
13C ya bo me tula bidimbu ya aside organique. Ba nsangu ya mvingu ya bantu yina me bikala (55μl) me fiongunina na kusadilaka nzila ya mvingu ya bantu (ICS 5000+, mvingu ya bantu) yina me vukana na nzila ya mvingu ya bantu (QE-HF). Na bunkufi, bo tulaka 5μl ya bima ya bo me katula na nitu na kati ya ntunga ya Dionex IonPac AS11-HC yina kele ti HPLC (2 mm×250 mm, nene ya bitini 4μm, Thermo Fisher Scientific) na mutindu ya kupusa na kati ya nsinga ya kitini ya ke vandaka ti ntalu ya kufulusa 1. )na zulu. Mulongo ya ke taninaka (2 mm x 50 mm, 4 μm, ya siansi ya ke lobaka mbisi ya tiya). Bo ke tulaka tiya ya koloni na 30°C, mpi bo ke tulaka kima yina ke bakaka bima na zulu ya masa na 6°C. Sadila cartouche ya potassium yina bo me pesa masa ya kukonda ion sambu na kubasisa nsinga ya potassium na nzila ya générateur d’éluent. Kukabula bima ya ke sadisaka na kubasisa masa na vitesi ya 380μl/min, na kusadilaka mutindu yai: miniti 0 tii na 3, KOH 10 mM; 3 tii na 12, KOH 10 tii na 50 mM; 12 tii na 19, KOH 50 tii na 100 mM; 19 tii na 21 , 100 mM ya KOH; 21 tii na 21,5, 100 tii na 10 mM ya KOH. Bau vutulaka ntungulu na nsi ya KOH 10 mM na nsungi ya miniti 8,5.
Bau ke vukisaka bima yina ke katukaka na nitu ti masa ya ke yikaka isopropanol na nima ya ntungulu mpi na nima bo ke tindaka yo na nzila ya spectromètre ya masse ya ngolo yina ke salaka na mutindu ya ionisation ya mbi. MS ke na kutala ntalu ya masa banda na m/z 50 tii na 750 na nsuka ya 60 000. AGC ke tulamaka na 1×106, mpe ntangu ya ion ya kuluta mingi ke bumbanaka na 100 ms. Kuyoka ya ESI vandaka kusala na ngolo ya 3,5 kV. Baparametre yankaka ya kisina ya ion kele mutindu yai: tiya ya kapilere 275°C; fulu ya gaz ya nsinga, 60 AU; fulu ya gaz ya kusadisa, 20 AU na 300°C, mpi kutula lenti S na 60 AU.
Kufimpa bansangu ya 13C ya bo me tula bidimbu. Sadila logiciel TraceFinder (version 4.2, ya siansi ya thermofisher) samu na kufiongunina bansangu ya ntalu ya ba isotope. Bau zikisaka kimuntu ya konso kimvuka na nzila ya kimvuka mosi ya referansi ya kutudila ntima mpi bau tadilaka yau na kimpwanza yonso. Samu na kusala lusalusu ya kutunga ba nsangu, ba katulaka kisika ya nsangu ya ba nsangu (XIC) ya konso nsangu ya 13C (Mn) na [M + H] +, kisika n kele ntalu ya carbone ya kimvuka yina ba ke zola kuzwa, yina ba ke sadilaka samu na kufiongunina ba acide aminé to [ MH] + ke sadilamaka samu na kufiongunina ba anion. Kulunga ya masa ya XIC kele na nsi ya bitini tanu na milio mosi, mpe kulunga ya RT kele na miniti 0,05. Kufiongunina ya kimvwama kesalamaka na kutangaka ntalu ya konso isotope yina bo memona na ntalu ya isotope yonso ya kimvuka yina kewakana ti yo. Ba ntalu yayi ke pesamaka na mutindu ya ntalu ya konso isotope, mpe ba mvutu ke monisamaka mutindu ntalu ya mvingu ya bantu (MPE), mutindu beto me tubila yau na zulu (42).
Bau vukisaka mbuma ya misisa ya butomfu yina mekuma madidi na 80% ya madidi ya glace (v/v), bau tulaka yau na zulu ya masa, mpi bau tulaka yau na -20°C na nsungi ya miniti 30. Kuvukisa diaka échantillon mpe kuvukisa na +4°C na miniti 30. Bau tulaka ba échantillons na 21 000 g na miniti 5 na 4°C, na nima bau vukisaka masa yina basikaka mpe bau yumisaka yau na kusadilaka kisadilu ya SpeedVac na 25°C samu na kufiongunina yau na manima. Mutindu beto me tubila yo na zulu, bo salaka bansosa ya LC-MS na ba acide aminé ya baselile yina bo ponaka. Na kusadilaka TraceFinder (kifwanisu 4.2, ya siansi ya Thermo Fisher), bo salaka bansosa ya bansangu na kusadilaka masa ya konso kima yina bo me vukisa. Kubongisa ya ntalu ya bansangu ya bima yina ke basikaka na nitu me salama na kusadilaka logiciel ya preprocesse (57).
Kuyidika bitini. Bo tulaka nswalu-nswalu anesthésie na mputa yina ti dioxyde de carbone mpi bo zengaka yandi ntu, bo katulaka butomfu na yandi nswalu-nswalu na ntu, mpi bo sadilaka munduki yina vandaka kunikana yina vandaka ti glace (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Allemagne) sambu na kuzenga yo na bitini ya 300 tii na 375 μm ya carbone O5d. CO2) Ca2 ya fioti + ACSF (125,0 mM ya NaCl, 2,5 mM ya KCl, 1,25 mM ya tampon ya fosfate ya sodium, 25,0 mM ya NaHCO3, 25,0 mM ya d-sukadi, 1,0 mM ya CaCl2 mpi 6,0 mM ya Adjust na pH30. mOsme). Nata bitini ya butomfu yina bo me baka na kisika yina kele ti Ca2 + ACSF mingi (NaCl 125,0 mM, KCl 2,5 mM, tampon ya fosfate ya sodium 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, pH72 mM ya d-glucose, 4,0 mM ya Ca5C. mpi 310 tii na 320). Bumba bitini yina na miniti 20 to 30 sambu nge vutula yo na ntwala ya kusala enregistrement.
kukanga enregistrement. Bau sadilaka estrade mosi ya mikroskope yina kele na kisika ya kukangama ya kukangama mpi kima mosi ya bo ketulaka na masa mbala 20 (Scientifica) sambu na kukanga bansangu yonso. Bo zabaka baselile ya Purkinje yina bo vandaka kuyindula nde yo kele na (i) nene ya nitu, (ii) kisika yina butomfu ya ntu kele, mpi (iii) mutindu gène ya mtYFP yina ke pesaka bansangu ke basikaka. 150-10, 0,86 mm×1,5 mm×100 mm, Bima ya siansi, Hofheim, na Allemagne) mpi na nzila ya pipete ya ke kangamaka na zulu ya ntoto (Pipette). Bau salaka ba enregistrement yonso na nsadisa ya kisadilu mosi ya bo kebingaka ELC-03XS ( npi électronique GmbH, Tam, Allemagne ), yina bo vandaka kutwadisa na nsadisa ya logiciel Signal (version 6.0, Royaume-Uni). Bau sonikaka eksperiansi yina na vitesi ya 12,5 kHz. Bau ke filtrer signal na ba filtre zole ya Bessel ya ke lutaka na ntangu fioti na ba frequence ya kuzenga ya 1,3 mpe 10 kHz. Kukangama ya membrane na pipete ke futama na nzila ya nziunga ya kufuta na kusadilaka amplificateur. Ba eksperiansi yonso salamaka na nsi ya kiyeka ya kamera mosi ya Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Allemagne), yina vandaka kutwadisama na nzila ya logiciel Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Allemagne).
Kuyidika mpi kusala bansosa ya baselile ya mvimba ya mbala na mbala. Mbala na ntwala ya kusonika, fulusa pipette ti masa ya kati yina kele ti bima yai: 4,0 mM ya KCl, 2,0 mM ya NaCl, 0,2 mM ya EGTA, 135,0 mM ya gluconate ya potassium, 10,0 mM ya Hepes, 4,0 mM ya ATP. (Na) mpe 10,0 mM ya fosfate ya créatinine vuandaka na pH 7,25, mpe ngolo ya masa vuandaka 290 mOsm (sucre). Mbala na nima ya kusadila ngolo ya 0 pA sambu na kupasula nsinga ya nsinga, bo tesaka ngolo ya nsinga ya kupema. Bau ke tesaka ngolo ya kukota na kusadilaka ba courant ya kuluta ngolo ya -40, -30, -20, mpe -10 pA. Tesa nene ya mvutu ya tension mpe sadila nsiku ya Ohm samu na kuzaba ngolo ya kukota. Bau sonikaka bisalu ya kukonda kukana na nsadisa ya pense ya ngolo na nsungi ya miniti 5, mpe bau zabaka mpe tesaka sPSC na Igor Pro (mukanda ya 32 7.01, Lac Oswego, Oregon, États-Unis) na kusadilaka script ya kuzaba yina ke salamaka na ndambu. Bau ke tesaka nzila ya IV mpe nzila ya kukangama na kukangaka bateri na ba ngolo ya kuswaswana (kubanda na -110 mV) mpe kumatisa ngolo na bitambi ya 5 mV. Bau mekaka kusala AP na kusadilaka courant dépolarisant. Kukanga selile na -70 mV ntangu nge ke sadila nsinga ya ke katulaka ngolo. Soba nene ya bitambi ya konso kima ya bo ke sonikaka na mutindu na yo (10 tii na 60 pA). Kusala calcul ya fréquence ya AP ya kuluta mingi na kutangaka na maboko ba nsinga ya pulse yina ke salaka nde fréquence ya AP kuluta mingi. Bau ke fimpaka nsuka ya AP na kusadilaka nzila ya zole ya mvingu ya bantu yina ke basisaka ntete AP mosi to mingi.
Kuyidika mpi kusala analize ya bima ya bo me tobula. Sala enregistrement ya bisika ya bo me tobula na kusadilaka bansiku ya bo me yidika. Sadila pipete ya kukonda ATP mpe GTP yina kele na bima yayi ve: 128 mM ya gluconate K, 10 mM ya KCl, 10 mM ya Hepes, 0,1 mM ya EGTA mpe 2 mM ya MgCl2, mpe kuyidika yau na pH 7,2 (kusadila KOH). Bo ke katulaka ATP mpi GTP na kati ya masa yina kele na kati ya baselile sambu na kukanga nzila nde masa kukota ve na kati ya baselile. Bau ke fulusaka pipete ya nsinga ya nsinga na masa ya kati yina kele na amphotéricine (kiteso ya 200 tii na 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) sambu na kubaka mukanda ya nsinga ya nsinga ya bo me tobula. Bau ketulaka amphotéricine na kati ya dimethyl sulfoxide (kiteso ya nsuka: 0,1 tii na 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Kuvukisa DMSO yina bo sadilaka vandaka ve ti bupusi ya ngolo na ba neurone yina bo longukaka. Na ntangu ya kisalu ya kubula makofi, bau vandaka kutala ntangu yonso ngolo ya nzila (Ra), mpe bau yantikaka kumeka na nima ya kukuma ya ngolo ya Ra mpe AP (miniti 20-40). Bau ke tesaka kisalu ya kukonda kukana na nsadisa ya pense ya tension mpe/to ya courant na miniti 2 tii na 5. Bau salaka kufiongunina bansangu na kusadilaka Igor Pro (mutindu ya 7.05.2, na États-Unis), na Excel (mutindu ya 2010, na États-Unis) mpe na GraphPad Prism (mutindu ya 8.1.2, na États-Unis). États-Unis). Sambu na kuzaba ba AP yina ke basikaka kaka mpidina, bo ke sadilaka plug-in ya IgorPro. Kuzaba na mbala mosi ba AP na kusadilaka bandilu mosi ya bo me pesa, yina bo ke yidikaka mosi-mosi sambu na konso disolo. Na kusadilaka ntangu ya kukangama, zaba mbala ya kukangama ti mbala ya kukangama ya mbala mosi ya kuluta mingi mpi mbala ya kukangama ya mwayene.
PN kukangama. Na kuyikama ti protocole yina bo basisaka ntete, bo katulaka ba PN na butomfu ya ntu ya mpuku na kitini mosi buna (58). Na bunkufi, bo zengaka butomfu ya ntu mpi bo zengaka yo na nsadisa ya masa yina vandaka madidi bonso glase [ya kukonda HBSS Ca2+ mpi Mg2+, bo yikaka yo ti sukadi 20 mM, penisiline (50 U/ml) mpi streptomycine (0,05 mg/ml)], mpi na nima bo yikaka yo na nsadisa ya masa yina ti papal1. / ml), papaine (16 U / ml) mpe deoxyribonukléase I (ADN I; 0,1 mg/ml)] Kusadila yau na miniti 30 na 30°C. Ntete, yobisa mikanda na masa ya HBSS yina kele ti mucus ya diaki (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) mpi UNase (0,1 mg/ml) na tiya ya kisika yina bo ke zingaka sambu na kukanga nzila na kudia na nzila ya enzyme, mpi na nima na masa ya HBSS yina kele ti sukadi 20 mM), kuzenga na mawete yonso na masa ya HBSS. (0,05 mg/ml) mpi DNase (0,1 mg/ml) ke basisaka baselile mosi-mosi. Bau vandaka kufiltrer masa ya baselile yina kubasikaka na nzila ya filtre ya baselile ya 70μm, na nima bau vandaka kutula baselile yina na nzila ya centrifugation (1110 rpm, miniti 5, 4°C) mpi bau vandaka kutula yau dyaka na kati ya kima ya kupona [HBSS, ya kuyika 20 mM ya sukadi, 20% ya streptomyline ya ngombe ya divumu) Sérum, (0,05 mg/ml)]; kutadila mutindu baselile lenda zinga ti iode ya propidium mpi kuyidika ntalu ya baselile na 1×106 tii na 2×106/ml. Na ntwala ya kusala cytométrie de flux, bo vandaka kufiltrer masa yina na nzila ya filtre ya baselile ya 50 μm.
Cytomètre ya ke tambula. Bau salaka kupona ya baselile na 4°C na kusadilaka masini ya FACSAria III (Biolozi ya BD) mpe logiciel ya FACSDiva (Biolozi ya BD, version 8.0.1). 100 μm na nsi ya ngolo ya 20 psi na vitesi ya ~2800 mambu/sec. Sambu mambu ya ntama ya kukanga bakielo (nene ya baselile, kuswaswanisa mitindu zole, mpi bikalulu ya kupanzana) lenda sala ve nde PN kukabwana mbote ti mitindu ya nkaka ya baselile, bo ke tulaka mayele ya kukanga bakielo na kutadila kufwanisa ya mbala mosi ya ngolo ya YFP mpi ya ke basikaka na mitoYFP+ ​​mpi na mitoYFP ya ke twadisaka. YFP ke sepelaka na kupesa nsemo na mbandu yina ti nzila ya laser ya 488 nm, mpi bo ke zabaka kidimbu yina na kusadilaka filtre ya ke lutaka na bande ya 530/30 nm. Na bampuku ya mitoYFP+, ngolo ya fioti ya gène yina ke pesaka bansangu ya Rosa26-mitoYFP ke sadilamaka mpi sambu na kuswaswanisa nitu ya misisa ya butomfu mpi bitini ya misisa ya butomfu. 7-AAD ke pesa kiese na laser ya jaune ya 561 nm mpi ke zabanaka ti filtre ya 675/20 nm sambu na kukatula baselile ya kufwa. Sambu na kukabula ba astrocyte na ntangu mosi, bo tulaka ACSA-2-APC na zulu ya nsinga ya baselile, na nima bo tulaka nsinga ya laser ya 640 nm na mbandu yina, mpi bo sadilaka filtre mosi ya ke lutaka na bande ya 660/20 nm sambu na kuzaba kidimbu yina.
Bau ke vukisaka baselile yina na nzila ya nsinga ya kuyoka (1110 rpm, miniti 5, 4°C) mpe bau ke bumbaka yau na -80°C tii kuna bau ke sadila yau. Ba nsusu ya Mfn2cKO na bana ya bau ya kubuta ke tulamaka na kilumbu mosi samu na kufiongunina kusoba ya mutindu ya kusadila. Kumonisa mpe kufiongunina bansangu ya FACS salamaka na nsadisa ya logiciel FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, États-Unis).
Mutindu beto me tubila yo na zulu (59), bo ke sadilaka PCR na ntangu ya kieleka sambu na kukatula ADN na ba neurone yina bo me pona sambu na kuzaba ntalu ya mtDNA na nima. Bau mekaka ntete nzila mosi ti nzila ya kukangama na nzila ya kusala qPCR na ba ntalu ya kuswaswana ya baselile. Na bunkufi, vukisa 300 PN na kati ya tampon ya lyse yina kele na tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 1 mM, Tween 20 0,5% mpe proteinase K (200 ng/ml) mpe tula yau na 55°C na miniti 120. Bau tulaka diaka baselile na 95°C na nsungi ya miniti 10 sambu na kuzikisa nde proteinase K ke sala ve ata kima mosi. Siansi, nimero ya mukanda Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Siansi ya Bambisi ya Ntoto, nimero ya mukanda AIVI3E8) mpi 18S (Siansi ya Bambisi ya Ntoto, nimero ya mukanda Hs99999901_s1) ya ba gènes.
Kubongisa mbandu ya proteine. Na kutulaka tiya na masa yina na 95°C na nsungi ya miniti 10 mpi na kutula yo na nsadisa ya ndinga, na kati ya tampon ya lyse [6 M ya chlorure de guanidine, 10 mM ya chlorure de phosphine, 10 mM ya chloroacétamide mpi 100 mM ya chlorure de tris-HC na neuron ya kukangama]. Na Biorupteur (Diagenode) na miniti 10 (basegonde 30 ya kubula / basegonde 30 ya kupema). Bau tulaka bima yina na 1:10 na 20 mM ya tris-HCl (pH 8,0), bau vukisaka yau na 300 ng ya wolo ya trypsine (Promega), mpe bau tulaka yau na mpimpa ya mvimba na 37°C samu na kuzwa mvingu ya bantu. Na kilumbu ya zole, bau ke tula échantillon na 20 000 g na nsungi ya miniti 20. Bau tulaka masa yina vandaka na zulu ya masa yina na 0,1% ya acide formique, mpe bau katulaka mungwa na masa yina na StageTips yina bau salaka bau mosi. Bau yumisaka mbandu na kisadilu ya SpeedVac (kima ya ke vukisaka masa ya Eppendorf na 5305) na 45°C, na nima bau tulaka bima yina na 0,1% ya acide formique. Ba échantillons nyonso ba bongisaka yau mbala mosi na muntu mosi. Na nsadisa ya kufimpa bambandu ya ba astrocyte, bo tulaka bidimbu ya 4 μg ya ba peptide ya kukonda mungwa ti kidimbu ya masa ya ke vukisaka (TMT10plex, nimero ya mukanda 90110, Thermo Fisher Scientific) ti ntalu ya 1:20 ya ba peptide na réactif ya TMT. Samu na kutula bidimbu ya TMT, ba vutulaka 0,8 mg ya réactif ya TMT na kati ya 70 μl ya ACN ya kukonda masa, mpe ba vutulaka peptide ya kuyuma na 9 μl ya TEAB 0,1 M (bicarbonate de triéthylammonium), na kati ya yau ba yikaka 7 μl ya réactif ya TMT na ACN. Kuvukisa bantu vandaka 43,75%. Na nima ya miniti 60 ya kukangama, bau ke fwaka mvingu ya bantu na 2 μl ya 5% ya hydroxylamine. Bau vukisaka ba peptides yina me sonikama, bau yumisaka yau, bau tulaka yau diaka na 200μl ya acide formique (FA) 0,1%, bau kabulaka yau na bitini zole, mpe na manima bau katulaka mungwa na kusadilaka ba StageTips yina bau salaka bau mosi. Na kusadilaka kisadilu ya masa ya ngolo mingi (kisadilu ya masa ya ngolo mingi), bo kabulaka ndambu mosi na kati ya bitini zole yina na zulu ya zulunalu mosi ya Acquity ya 1mm x 150mm yina vandaka ti bima ya fioti-fioti ya C18 (NoWaters, catalog150). Muntu ya ke lobaka mbisi ya masa). Kukabula ba peptide na vitesi ya 30μl/min, kukabula na 1% tii na 50% ya tampon B na miniti 85 na nzila ya kutambula na nzila ya miniti 96, katuka na 50% tii na 95% ya tampon B na miniti 3, na nima miniti 8 na 95 % ya tampon B; Tampon A kele 5% ya ACN mpe 10 mM ya ABC, mpe tampon B kele 80% ya ACN mpe 10 mM ya ABC. Kuvukisa bitini na nima ya miniti 3 mpe kuvukisa yau na bimvuka zole (1 + 17, 2 + 18, mpe buna na buna) mpe kuyumisa yau na centrifuge ya vide.
Kufimpa mambu na nzila ya LC/MS. Na yina metala spectrométrie ya masse, bo kabulaka ba peptide (nimero r119.aq) na zulu ya ntu ya 25 cm, 75 μm ya diametre ya kati (lentille objectif ya mpa, nimero ya kitini PF7508250) yina kele ti 1,9 μm ya ReproSil-Pur Cmrse, 120. 1200 (Muntu ya kelobaka mbisi ya masa, Allemagne). Bo vandaka kutanina koloni yina na 50°C. Ba tampon A na B kele 0,1% ya aside formique na masa mpe 0,1% ya aside formique na 80% ya ACN, na kulandana. Bau kabulaka ba peptides na nzila ya 200 nl/min banda na 6% tii na 31% ya tampon B na miniti 65, mpe banda na 31% tii na 50% ya tampon B na miniti 5. Bau fimpaka ba peptide yina bau katulaka na nzila ya kisadilu mosi ya bo kebingaka nde spectromètre de masse. Kutesa m/z ya ntwala ya ba peptide ke salama na nsuka ya 120 000 na kati ya 350 ti 1500 m/z. Na kusadilaka 27% ya ngolo ya kubula ya kufwanana, ntuadisi ya ngolo yina kele na kikalulu ya charge ya 2 tii na 6 ke ponamaka samu na kuzenga ya ngolo ya C ya mutambu (HCD). Ntangu ya sikle ke tulamaka na 1 s. Bau me tesaka ntalu ya m/z ya kitini ya peptide na mutambu ya ba ion na kusadilaka AGC ya fioti ya 5×104 mpe ntangu ya kutula ntunga ya kuluta mingi ya 86 ms. Na nima ya kukabula, bo tulaka ntuadisi na liste ya kukatula ya ngolo na nsungi ya 45 s. Bau kabulaka ba peptides yina me sonikama na TMT na zulu ya zulunalu mosi ya nene ya 50 cm, 75 μm ( Thermo Fisher Scientific, nimero ya mukanda 164942), mpe bau fimpaka ba nzila ya kutambula na zulu ya nzila ya mvingu ya bantu na nzila ya mvingu ya bantu na nzila ya mvingu ya bantu. ( FAIMS ) bisadilu ( Thermo Fisher Scientific ) ke salaka na ba voltage zole ya lufutu ya −50 mpi −70 V. 1200, na kusadilaka 90% ya nzila ya kuyoka, na 6% tii na 31% ya tampon; tampon A vandaka 0,1% ya FA, mpe tampon B vandaka 0,1% ya FA mpe 80% ya ACN. Kusala analyse ke salaka na 50°C. Sadila mutindu ya kukonda mindondo (version 1.6, ya siansi ya thermofisher) sambu na kukabula fichier ya kisina na kulandaka tension ya lufutu ya FAIMS.
Kuzaba proteine ​​mpi kuzaba ntalu na yo. Na nsadisa ya masini ya kusosila bansangu ya Andromeda yina bo me vukisaka, bo tadilaka bansangu ya kisina na nsadisa ya version 1.5.2.8 ya MaxQuant. Na zulu ya ndonga ya Cre ya kuvukisa mpe YFP yina ba bakaka na Aequorea victoria, ba sosaka ba nzila ya bitini ya ba peptide samu na ndonga ya canonique mpe ndonga ya isoforme ya mvingu ya bantu (ID ya mvingu ya bantu UP000000589, yina ba bakaka na UniProt na ngonda ya tanu 2010). Bo tulaka oksidasio ya metionine mpi nsuka ya N ya proteine ​​bonso bansoba yina ke sobaka; bo tulaka methylation ya cystéine bonso bansoba ya kukonda kusoba. Ba parametre ya kudia ke tulamaka na “kukonda kuzaba” mpi na “trypsine/P”. Ntalu ya fioti ya ba peptide na ba peptide ya rasoir yina bo ke sadilaka sambu na kuzaba ba proteine ​​kele 1; ntalu ya fioti ya ba peptide ya kuswaswana kele 0. Na nsi ya mambu ya kufwanana ya karte ya ba peptide, ntalu ya kuzaba ba proteine ​​vandaka 0,01. Bo me tula “Peptide ya Zole.” Sadila “kufwanana na kati ya bansaka” sambu na kupesa bidimbu ya kununga na kati ya bafishe ya kisina ya kuswaswana. Sadila LFQ ntalu ya fioti 1 samu na kuzaba ntalu ya kukonda bidimbu (LFQ) (60). Kufiltrer ya ngolo ya LFQ samu na ata ba ntalu zole ya mbote na ata kimvuka mosi ya genotype na konso ntangu, mpe ke katukaka na kukabula ya mbote na nene ya. 0,3 mpi kukwenda na nsi 1,8. Sadila plateforme ya ordinatere ya Perseus () na R () samu na kufiongunina ba mvutu ya LFQ. Bau sadilaka t test ya nzila zole ya kati-kati ya logiciel limma sambu na kufimpa bangogo ya kuswaswana (61). Kufiongunina ba nsangu ya kusosa ke salama na kusadilaka ggplot, ba nsangu ya kieleka, ba nsangu ya nkaka, ba nsangu ya ba nsangu ya nkaka. Ba nsangu ya ba proteomiques ya me simbama na TMT me fiongunina na kusadilaka mutindu ya MaxQuant 1.6.10.43. Kusosa bansangu ya ntete ya proteomique na base de données ya proteomique ya bantu ya UniProt, yina bo bakaka na Septembri 2018. Kufimpa yina kele ti facteur ya kusungika bunkete ya isotope yina muntu yina salaka yo pesaka. Sadila limma na R sambu na kufimpa bangogo ya kuswaswana. Ba nsangu ya kisina, ba mvutu ya kusosa na ba nsangu, mpe mutindu ya kusala kisalu ya kufiongunina ba nsangu mpe ba mvutu nyonso ke bumbanaka na kimvuka ya ProteomeXchange na nzila ya kisika ya kubumba bansangu ya ba nduku ya PRIDE na kizitu ya kimvuka ya ba nsangu PXD019690.
Banoti ya kisalu ke kumisaka ngolo analize. Ba sadilaka kisadilu ya kufiongunina nzila ya mayele (QIAGEN) samu na kuzaba kimvwama ya ba ngogo ya bansoniki ya bisalu ya kimvuka ya ba nsangu na ba mposo 8 (Kifwanisu 1). Na bunkufi, liste ya ba proteine ​​ya ntalu yina ba me baka na nzila ya kufiongunina ba nsangu ya LC-MS/MS (spectrométrie de masse en tandem) ke sadilama na ba nzila ya kufiltrer yayi: Bau ke ponaka misisa ya muscle mutindu mutindu na ntuala, mpe ndonga ya ke monisa ntalu ya P yina Benjamini me yidika samu na kutunga 0,05 to na nsi ke tadisama mfunu. Samu na graphique yayi, ba ndonga ya kuluta tanu ya ntete na konso kimvuka na kutadila ntalu ya P yina me bongisama me monisama. Na kusadilaka ba t-test mingi, na kusadilaka programe ya kupesa ngolo na nzila ya bitini zole ya Benjamini, Krieger, mpe Yekutieli (Q = 5%), ba ke salaka lusalusu ya ntangu na bantu ya mfunu yina me zabana na konso ndonga, mpe ba ke lusalusu konso ndonga mosi mosi. Mfunu kele ve ya kundima SD mosi ya kelandanaka.
Samu na kufwanisa ba mvutu ya kulonguka yayi na ba nsangu yina me basisama mpe kubasisa kifwanisu ya Venn na kifwanisu 1, beto vukisaka liste ya ba proteine ​​ya ntalu na ba nsangu ya MitoCarta 2.0 (24). Sadila kisadilu ya internet Dessin le diagramme de Venn ( ) samu na kusala kifwanisu.
Samu na kuzaba mambu mingi na yina me tala ba nzila ya kusadila ba ntalu samu na kufiongunina ba proteomique, tala kitini ya ke tadila Bima mpe ba nzila. Sambu na ba eksperiansi yonso ya nkaka, nge lenda mona bansangu ya fioti-fioti na legende yina ke wakana ti yo. Katula kaka kana ba me monisa mutindu ya nkaka, ba nsangu nyonso me monisama na mutindu ya mwayene ± SEM, mpe ba nsangu nyonso ya kufiongunina ba nsangu me salama na kusadilaka logiciel GraphPad Prism 8.1.2.
Sambu na kuzwa bima ya nkaka ya disolo yai, tala http://advances.sciencemag.org.
Yai kele disolo mosi ya bantu yonso lenda kota mpi bo me kabulaka yo na nsi ya bansiku ya Nswa ya Kupesa Bima-Kukonda Kusala Bisalu, yina ke pesaka nswa ya kusadila, kukabula mpi kubasisa yo na konso mutindu yina, kana kusadila ya nsuka kele ve sambu na mbongo ya mumbongo mpi kana lukanu kele nde kisalu ya kisina kele ya mbote. Referansi.
Noti: Beto ke lomba nge kaka na kupesa adresi na nge ya e-mail sambu muntu yina nge ke pesa zina na yandi na lutiti kuzaba nde nge ke zola nde yandi mona e-mail yina mpi nde yo kele ve e-mail ya mbi. Beto ta kanga ve ata adresi mosi ya ba e-mail.
Ngiufula yai ke sadisamaka sambu na kumeka kana nge kele munzenza mpi kukanga nzila na kutinda bansangu ya mbi na mbala mosi.
Na nsadisa ya mambu yina bo sonikaka na zulu ya mukanda yai, yandi sonikaka mambu yai. Larson
Kufimpa ya proteomique ya ba neurone yina ke salaka ve mbote monisaka nde bo ke salaka baprograme ya ke sadisaka nitu na kukanga nzila na kubeba ya misisa.
Na nsadisa ya mambu yina bo sonikaka na zulu ya mukanda yai, yandi sonikaka mambu yai. Larson
Kufimpa ya proteomique ya ba neurone yina ke salaka ve mbote monisaka nde bo ke salaka baprograme ya ke sadisaka nitu na kukanga nzila na kubeba ya misisa.
©2020 Kimvuka ya Amerika sambu na Kuyela ya Siansi. banswa yonso kele ya bo me bumba. AAAS kele nduku ya HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CroixRef mpi COMPTEUR. 2375-2548.