Bubu yai†Adrese ya ntangu yai: OX11 0DE, Royaume-Uni, Nzo ya Diama, Parc ya Siansi mpi ya Bima ya Mpa ya Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Royaume-Uni, Co.
(RC-LH1) kele kima ya mfunu yina ke salaka nde bamikrobe ya violet yina ke diaka nsemo kukuma ngolo. Beto kotisaka bima zole ya ke sadisaka na kumona mambu na mutindu ya mbi (cryo-électronique) ya kimvuka ya RC-LH1 yina me katuka na nzioku ya nzioko. 2,65-Å ya RC-LH114-W kele ti ba-boucle 14 ya LH1 yina kele na nziunga ya RC, yina ke zenganaka na proteine ​​W, kansi kimvuka yina kele ve ti proteine-W kele mvimba-mvimba kimvuka ya RC yina me ziunga RC. Kukangama 16 ya fioti ya LH1. Kufwanisa ya ba ntungulu yayi ke pesa mayele na yina me tala mutindu ya kutambula ya quinone na kati ya kimvuka ya RC-LH1, na kati na yau bansoba ya mutindu ya kutunga yina ba zabaka ve ntete ntangu ya kukangama ya quinone na kifulu ya RC QB, mpe kisika ya bisika ya kukangama ya quinone ya nsadisa, yina ke sadisaka na Kupesa yau na RC. Mutindu ya kuswaswana ya proteine ​​W ke kangaka nzila na kukangama ya nsinga ya LH1, ebuna yo ke salaka nzila sambu na kusoba nswalu-nswalu bima yina ke vandaka na kati ya bima ya nkaka.
Ngolo yina photosynthèse ke pesaka lenda kusimba luzingu nyonso na ntoto, mpe yawu kele na ngolo mingi samu na biolozi ya ntangu. Ata yo ke sadisaka na kusala kisalu ya ngolo na ntoto ya mvimba, bamikrobe ya violet yina ke diaka ngolo ke monisaka mpi mitindu ya kuswaswana ya ngolo mpi makuki ya kusoba bima. Bo lenda buya kusala kisalu ya nsemo mpi kuyela bonso bamikrobe yina ke diaka bima ya nkaka na mpimpa, bo lenda yidika azote mpi mupepe ya mbi, kubasisa hydrogène mpi kubebisa bima yina ke vandaka ti nsudi ya kitoko (1-3). Samu na kupesa ngolo na bisalu yayi, nsemo fwana kubaluka nswalu mpe mbote na ngolo ya kimunganga. Nsadulu yai ke yantikaka ntangu kimvuka ya antene yina ke kangaka nsemo ke bakaka nsemo mpi ke nataka ngolo yina me kangama na kisika yina bo ke salaka mambu (RC), ebuna yo ke yantikaka kukabula charge (4 – 7). Kitini ya mfunu ya fotosintese na bamikrobe ya violet yina ke diaka nsemo kele ti RC ya mutindu 2, yina me ziungama ti kimvuka ya ke bakaka nsemo 1 (LH1), yina ke salaka kimvuka ya ntete ya RC-LH1. LH1 ke salamaka na nsadisa ya kimvuka ya ba αβ yina ke balukaka, konso kitini na kati na yo ke vukisaka bamolekile zole ya bamikrobe (BChl) mpi bamolekile mosi to zole ya bamikrobe (8-12). Antenne ya LH1 ya kuluta pete kele ti ba αβ 16 to 17 yina ke ziungaka RC (9-13) na nzila ya nsinga ya kukangama, kansi na ba peptide ya nkaka ya kati, ba peptide yina ke lutaka na kati ya ba peptide ke zengaka kulandana ya LH1 yina kele na nziunga , Na mutindu yina, yo ke sadisaka na kumwangana ya quinol/quinone mpi kimvuka ya bRC1. 13-15). Nti ya violet yina ke diaka nsemo (Rps.) kele kigangwa ya mbandu yina lenda bakisa ngolo mpi mutindu ba électrons ke sadisaka na kusala nsemo. Kusala ya ntete ya kristale ya Rps. Mutindu ya kimvuka ya RC-LH1 ya palustris kele RC, ya mezyungama na banzila 15 ya LH1 ya kuswaswana, yina kekatukaka na proteine ​​mosi ya mezabanaka ve ya bo kebingaka nde “Protéine W” (14). Na nima, bo zabaka nde proteine-W kele RPA4402, yina kele proteine ​​mosi ya kele ti bikalulu ya 10,5kDa yina kele ti ba hélices tatu yina bo me bikulaka nde yo ta vanda na zulu ya ntu (TMH) (16). Beto ke pesa dibanza ya kusoba zina ya rpa4402 yina ke pesaka bakode na proteine ​​W na pufW sambu yo wakana ti zina yina bo ke sadilaka sambu na ba gène yina ke pesaka bakode na ba unités ya fioti ya RC-L, M (pufL, pufM). Kima ya kebenda dikebi kele nde, proteine-W kele kaka na kiteso ya 10% ya RC-LH1, yina kemonisaka Rps. palustris ke basisaka bima zole ya kuswaswana ya RC-LH1. Awa, beto ke tubila mutindu bima zole ya mfunu ke salaka, mosi kele ti proteine ​​W mpi αβ 14, ya nkaka kele ve ti proteine ​​W mpi nsinga ya LH1 ya kukangama. Kubongisa na beto ke monisa nsobolo ya kitambi na kubakisa kimvuka ya RC-LH1 ya Rps. palustris, sambu beto me tadila ntalu ya bantu yina kele kiteso mosi na konso mutindu mpi beto kele ti lukanu ya kufwana sambu na kupesa na pwelele konso peptide mpi bima yina ke kangaka mukubu mpi mafuta mpi bima yina ke wakana ti yo. Kufwanisa ya bima yai ke monisa nde ba proteine ​​tatu ya TMH-W yina bo me monaka ve na konso kimvuka ya nkaka ya RC-LH1 tii bubu yai ke basisaka nzila ya kinone sambu na kupesa nswalu nsoba ya kinone/kinone. Bau me zaba bisika mingi ya kukangama ya mafuta mpe ya kinone yina me bumbana, mpe beto me monisa nsobolo ya mpa ya mutindu ya kutunga na manima ya kuvukisa kinone mpe RC, yina lenda fwanana na RC ya fotosysteme II (PSII) ya bibulu yina ke diaka nsemo yina kele na oxygène. Ba mvutu ya beto me pesa mayele ya mpa na yina me tala mutindu ya kukangama ya kinone/kinolone mpi kusoba na kati ya kimvuka ya RC-LH1 ya bamikrobe ya violet yina ke diaka nsemo.
Samu na kupesa nzila na kulonguka ya fioti ya ba complexes zole yina me monana na Rps. palustris, beto ke katulaka konso RC-LH1 na nzila ya bametode ya biolozi. Bo katulaka kimvuka ya proteine ​​yina kele ve ti proteine ​​W (yina bo ke bingaka na nima ΔpufW) na kimvuka yina kele ve ti gène ya pufW (16), mpi bo lenda basisa kaka kimvuka mosi ya RC-LH1. Proteine ​​W yina kele na kimvuka ke basikaka na nzila ya kimbefo mosi. Bo ke sobaka proteine ​​W ya kifwani yai ti kidimbu ya His 10x na nsuka na yo ya C, na mpila nde bo lenda vukisa mbote-mbote kimvuka yina kele ti proteine ​​W ti proteine ​​W mingi yina ke konda na mutindu bo ke kangaka bibende. Bo ke kabulaka mbote-mbote bima yina kele na kati (16) Kusala na mutindu ya mbote (IMAC).
Mutindu ya ke monisama na kifwanisu 1, ba kimvuka nyonso zole kele na ba ndambu tatu ya RC (RC-L, RC-M na RC-H) yina me ziunga na antene ya LH1. Mutindu 2,80-A ya kimvuka yina kele ve ti proteine-W ke monisa ba αβ 16, yina ke salaka nsinga ya LH1 ya kukangama yina ke ziungaka mvimba-mvimba RC, yina bo ke bingaka na nima kimvuka ya RC-LH116. Mutindu ya 2,65Å ya kimvuka yina kele ti baproteine-W kele ti LH1 ya kele ti ba-hétérodimere 14 yina bo me zenga na proteine-W, yina bo ke bingaka awa RC-LH114-W.
(A na B) Kumonisa ya zulu ya kimvuka. (C mpi D) Bapigment ya kukangama yina bo ke monisaka na banti. (E mpi F) Bima yina bo ke monaka na zulu ya cytoplasme ke vandaka ti ba peptide mpi ba unité ya fioti ya LH1 yina bo ke monisaka na ba dessin animé, mpi bo ke tulaka yo na nimero na ndambu ya ntangu banda na kisika yina proteine ​​kele ti W [yo ke wakana ti nimero ya Rba. nsudi ya mbi (13)]. Sambu na LH1-α, mukubu ya kitini ya proteine ​​kele ya jaune; sambu na LH1-β, mukubu ya kitini ya fioti ya proteine ​​kele ya mbwaki; sambu na proteine-W, proteine ​​kele mbwaki; sambu na RC-H, yo kele mbwaki-ble; sambu na RC-L, yo kele Orange; sambu na RC-M, mbwaki-ble. Ba cofacteurs ke monisamaka na ba nsinga, vert ke monisaka ba molecule ya BChl mpe BPh a, violet ke monisaka ba caroténoïdes, mpe jaune ke monisaka ba molekile ya UQ10. (G mpi H) Kumona na mutindu ya nene kisika yina kele na kati ya baproteine-W na kisika yina kele kiteso mosi ti kimvuka ya RC-LH114-W (G) mpi kimvuka ya RC-LH116 (H). Ba cofacteurs ke monisamaka na mutindu ya kufulusa kisika, quinone chélé ke monisamaka na bleu. Dibulu ya proteine-W ke monisama na nzila ya nzila ya bleu na (G), mpi mabulu ya fioti kisika yina quinone/quinolol ke panzanaka na zulu ya nsinga ya LH116 ke monana na nzila ya ndombe na (H).
Kifwanisu 1 (A na B) ke monisa RC yina me ziunga na ba nzila ya kukangula to ya kukangama ya ba hétérodimères ya LH1αβ, mosi mosi na kati na yau ke vukisaka ba BChl zole na caroténoïde mosi (Kifwanisu 1, C na D). Ba nsosa ya ntete me monisa nde Rps kele kimvuka ya LH1. Na nzila ya bima yina ke zingaka na kati ya nseke, mitindu yai ke vandaka ti bima mingi ya ke sadisaka na nitu ( 17 ). Kansi, spiropyrroxanthine kele nkisi ya kuluta mingi mpi ntalu na yo ke sepedisaka. Na yina, beto ponaka na ku landa mbandu ya spiroxanthine na bisika nyonso yina LH1 ke vukanaka. Ba TMH mosi mosi yina kele na bisika ya nganda ya nkufi (Kifwanisu 1, A, B, E, mpe F). Ata bo monaka ve ntalu ya bima 17 yina bikalaka na nsuka ya C, bo katulaka alpha banda na Met1 tii na Ala46 na bima yonso zole. 116, mpi katuka na Ser5 tii na Tyr52 na RC-LH114-W. Ata ntalu mosi ve ya bima ya 3 to 4 ya nsuka ya N to 13 ya nsuka ya C me monana (Kifwanisu S1). Kufiongunina ya spectrométrie ya masse ya kimvuka ya RC-LH1 ya kuvukisa yina bo yidikaka na nzila ya mfinda ya mutindu ya mfinda monisaka nde kisika yina vandaka kukonda vandaka mbutu ya kukabwana ya mitindu ya kuswaswana ya ba peptide yai (Kifwanisu S1 mpi S2). Bau monaka mpi mutindu α-Met1 ke vandaka na nsuka ya N (f). Kufimpa yina monisaka nde α-peptide kele ti bima ya me bikala fMet1 tii na Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, mpi β-peptide kele ti bima ya me bikala Ser2 tii na Ala53, yina ke wakana mbote ti karte ya densité ya EM ya ke vandaka ti tiya ya fioti.
Kuwakana ya α-Yandi29 ti β-Yandi36 ke salaka nde ba BChl kukutana meso na meso; konso hétérodimere αβ ke vukanaka ti bamfinangani na yo sambu na kusala nsinga ya kukanguka (RC-LH114-W) to nsinga ya kukangama (RC-LH116) na nziunga ya RC Kimvuka ya bima yina ke basisaka mukubu (Kifwanisu 1, C mpi D). Kana beto fwanisa yo ti bande ya 877 nm ya RC-LH114-W, 880 nm ya kubaluka ya mbwaki ya kubaka masa ya RC-LH116 kele 3 nm (Kifwanisu 2A). Kasi, nzila ya dichroïsme ya nziunga kele pene-pene ya mutindu mosi (Kifwanisu 2B), yau ke monisa ti ata luswaswanu ya pwelele kele na kati ya ba nzila ya kukangula mpe ya kukangama, kisika ya kisika ya BChls kele mutindu mosi mingi. Kubaluka ya mbwaki ya ke bakaka masa lenda katuka na kukulumuka ya muvema ya tiya mpi na kukuma ngolo na zulu ya nsinga ya kukangama (18, 19), nsoba ya kukangama ya mukubu yina ke katukaka na nsinga ya kukangama (20, 21), to na kuvukisa mambu yai zole (11).
(A) Kubaka nsemo ya ngolo/ya kumonana/ya pene-pene ya ngolo, yina bansongi na yo ke vandaka ti bidimbu ya ke wakana ti yo mpi bo ke kumisaka yo kiteso mosi ti nsongi ya BPh na 775 nm. (B) Kufwana ya BChl na 805 nm. (C na D) Ba nzila ya ΔA ya kuponama na kati ya ba nzila ya kubaka masa yina bo me yidika na ntangu ya kimvuka ya RC-LH114-W (C) mpi ya kimvuka ya RC-LH116 (D). Sambu na kufwanisa mbote, ba spectre yonso ke vandaka ya kufwanana na ∆A ya −A na 0,2 ps. (E) Ntalu ya oxidation ya cytochrome c2 na nima ya kupesa radiasio na ntwala ya ba nsangu ya mutindu na mutindu ya UQ2 (tala kifwanisu S8 samu na ba nsangu ya ntete). (F) Na baselile yina me yela na nsi ya nsemo ya fioti, ya kati-kati to ya ngolo mingi (10, 30 to 300μMm-2 s-1, na kulandana), ba-unité ya fioti ya proteine ​​W mpi RC-L na kati ya kimvuka yina bo me sukula mpi ntalu ya membrane yina bo me kabula. Kuzaba kitezo ya proteine ​​na nzila ya électrophorèse ya gel ya SDS-polyacrylamide mpe ya immuno-essai (tala kifwanisu S9 samu na ba nsangu ya ntete). Kuzaba ntalu ya bima yina bo me kumisaka bunkete. Ntalu ya RC-L ti proteine-W ya kimvuka kele 1:1.
Ba BChl yina kele na kisika ya ntete na kati ya nsinga ya αβ14 ya kubeba ya RC-LH114-W (Kifwanisu 1, A, C, mpi E) kele pene-pene ya muntu yina ke pesaka menga ya ntete (P) na 6,8 Å kuluta ba BChl yina kele kiteso mosi na RC-LH116 (Kifwanisu 1, Kifwanisu 1, B, D); 114-W mpe RC-LH116, ba ntangu ya kupesa ngolo ya kupesa ngolo na RC kele 40 ±4 mpe 44±3 ps (Kifwanisu 2). , C na D, Kifwanisu S4 na Tablo S2). Kuvanda mpe ve na luswaswanu ya nene na yina metala kupesa mbongo na nzila ya internet na kati ya RC (Kifwanisu S5 mpe masonama ya ku yidika yina me tala yau). Beto ke yindula nde kuwakana ya ngolo ya ntangu ya kupesa ngolo na kati ya LH1 ti RC-P ke katukaka na kitamina, angle mpi ngolo ya ngolo ya mutindu mosi ya BChl mingi na ba nzila zole ya LH1. Yau ke monana ti kusosa kuzaba mutindu ya ngolo ya LH1 samu na kukuma na kitamina ya fioti kele ve nswalu kuluta kupesa ngolo mbala mosi na bisika ya mbote ve na RC. 114-W lenda mpi kukutana ti muvema ya tiya ya kukonda mfunu na nsi ya tiya ya fioti sambu na kusala bansosa ya ntungulu, mpi kele ti ngidika ya αβ14 ya nda na tiya ya nzo katuka na ntama ya βBChls na kisika ya RC 1.
RC-LH116 kele ti ba BChl 32 mpi ba caroténoïde 16, mpi mutindu na yo ya kusala mambu yonso kele kiteso mosi ti yina bo kebakaka na pidpidum ya bo kebingaka Thermochromatium (Tch. (12) mpi bambisi ya masa (Blc.viridis) (10). Na nima ya kutula na ndonga, kaka ba nzila ya fioti ya kukatuka na bisika ya ba αβ ya kuswaswana monanaka, mingi-mingi 1-5, 15, na 16 (Kifwanisu S6). Kuvanda ya proteine-W ke vandaka ti bupusi ya ngolo na mutindu LH1 ke salamaka. Ba TMH na yau tatu ke vukana na ba nzila ya nkufi, na nsuka ya N na ndambu ya lumière ya kimvuka mpe nsuka ya C na ndambu ya cytoplasme (Bifwanisu 1A mpe 3, A tii na D). Proteine-W ke zolaka mingi masa (Kifwanisu 3B), mpi TMH2 ti TMH3 ke vukanaka ti LH1αβ-14 sambu na kusala kisika yina ke lutaka na kati ya nsuni (Kifwanisu 3, B mpi E tii na G). Kukangama kele mingi-mingi na bima ya me bikala ya Phe, Leu mpi Val na kisika yina kele na kati ya nsinga ya nsinga. Bima yai ya ke bikalaka ke vandaka ti ba acide aminé yina ke kangaka masa mpi bima yina ke vandaka ti mukubu αβ-14. Ba résidus ya nkaka ya ba polaire ke sadisaka mpe na kusalasana, na kati na yau nsinga ya hydrogène na kati ya W-Thr68 na β-Trp42 na zulu ya dibulu ya mpasi (Kifwanisu 3, F na G). Na zulu ya ntu, Gln34 kele pene-pene ya kimvuka ya keto ya ba ntu ya αβ-14. Diaka, bo yidikaka mambu yina vandaka kusalama na nitu, mpi mukila na yo yina ke buyaka masa vandaka kukwenda tii na kisika yina proteine-W mpi αβ-14 ke kutana, mpi mukila ya mafuta lenda vanda na nitu. Beto me mona diaka ti bisika ya nsuka ya C ya proteine ​​W mpe RCH kele pene-pene mingi, kansi ve na kati ya kitezo ya kusala ba nguizani ya nkaka (Kifwanisu 1, A mpe E). Kansi, yo lenda vanda ti mambu yina ke wakana na kati ya ba acide aminé C ya nsuka ya baproteine ​​yai zole yina bo me yidika ve, yina lenda pesa mutindu ya kubaka baproteine-W na ntangu ya kuvukisa kimvuka ya RC-LH114-W.
(A) Protéine-W, yina ke talana ti kisika yina yo ke kutana ti LH1αβ14 na mutindu ya dessin animé, kele ti nsinga ya lweka yina kele bonso nti (ya mbwaki), yina bo ke monisaka na kitini ya kifwanisu ya ngolo ya kura (kisika ya gris ya ke monana mpi yina kele ti nivo ya 0,13). (B) Proteine-W yina bo me monisa na zulu ya kima mosi ya kele ti mukubu yina ke kangaka masa. Bisika ya polaire mpe ya charge ke monisamaka na cyan, bisika yina ke zolaka ve masa ke monisamaka na mpembe, mpe bisika yina ke zolaka ve masa mingi ke monisamaka na langi ya orange. (C mpi D) Proteine-W yina bo me monisa na dessin animé, mutindu yo ke talanaka kele kiteso mosi ti yina kele na (A) (C), mpi bo ke balulaka yo na 180° (D). Na kutadila kisika yina yo kele na ndonga, bima yina mebikala yina bo lenda swaswanisa kebakaka mukubu ya arc-en-ciel, kisika nsuka ya N kele ya bleu mpi nsuka ya C kele ya mbwaki. (E) Protéine-W na mutindu mosi ti yina kele na (A), mpi bima yina me bikala na kisika yina proteine-W:LH1 ke kutana ke monisama na banti yina kele ti bidimbu ya kukangama. (F) Protéine-W ke balukaka na 90° na yina me tala (E) mpi LH1αβ14 na kifwanisu ya dessin animé, mpi na yina me tala bima yina me bikala na kati ya kifwanisu ya barre. Bo ke tulaka bidimbu na bima yina ke bikalaka na zulu ya polypeptide beta. Cofacteur ke monisama bonso barre yina ke wakana ti mukubu ya kifwanisu 1, β-DDM yina me beba ke monisama na gris, mpi oxygène ke monisama na mbwaki. (G) Bo me balula kifwanisu yina kele na (F) na 180°, ti bima ya me bikala ya kumonana ya alpha yina bo me tula kidimbu.
Protéine-W ke bakaka kisika ya αβ mosi (ya 15 na kifwanisu 1F), ebuna yo ke kangaka nzila na kukangama ya nzila mpi na kunikisa αβ tatu ya ntete. Bau monaka nde angle ya kuluta nene ya kukangama ya αβ-1 ya ntete na yina metala filme ya kufwanana vandaka 25° tii na 29° (Kifwanisu 1, A ti E), yina kusalamaka na kukangama ya 2° tii na 8° ya αβ-1 na RC A ya kuswaswana ya ngolo-LH116 (Kifwanisu 1, B). Ba hétérodimere ya zole ti ya tatu ke balukaka na 12° tii na 22° mpi na 5° tii na 10°. Na nsadisa ya kigonsa ya stérique ya RC, kubwa ya αβ-1 ke vukisaka ve αβ zole (yina ke wakana ti αβ ya 16 na kifwanisu 1F), yo yina yo ke salaka kisika ya pwelele na kati ya nsinga ya LH1 (kifwanisu 1, A mpi E) . Sambu na kukonda ya ba αβ zole ya kuswaswana, yina kekwendaka nzila mosi ti kuvidisa ba BChl iya mpi ba BChl zole, ata BCh mosi ve kekangamaka na kitini ya αβ-1 yina mebalukaka, ebuna yo kesalaka nde bo basisa bague LH114-W yina kele ti ba BChl 13 ya Bantu yina kedyaka ve bambuma mpi ba BChl 28. Ba nsangu ya mvingu ya bantu zole na bisika ya αβ1 tii na 7 kele na nsi ya yina ya bima ya nkaka ya LH1, yina lenda monisa plasticité ya kubutuka ya kitini ya LH1 yina kele pene-pene ya kisika ya RC QB (Kifwanisu 4) .
Bifwanisu ya RC-LH114-W (A na B) na RC-LH116 (C na D) me monisama na mutindu mosi ya kutala na zulu/kutala na lweka (A na B) (A na C) na zulu ya dibulu ya kifwanisu 1. (B na D). Bafungula ya mukubu ke monisama na diboko ya kitata.
1:14 kele dimere ya Rhodococcus sphaéroïdes (Rba.) (13). Kansi, proteine ​​W ti PufX kele ve ti kuwakana ya pwelele, mpi yo kele ti bupusi ya ngolo na mutindu bo ke salaka LH1. PufX kele TMH mosi yina kele ti kitini ya nsuka ya N yina ke vukanaka ti ndambu ya nsuka ya RC-H (13) na kisika yina ke wakana ti Rps. 116αβ-16. PufX ke sala nzila samu na kusoba ba nsangu ya mvingu ya bantu na kati ya RC-LH1 na kimvuka ya bcl ya mvingu ya bantu mpe yau kele na ba Rba nyonso. nsinga ya nsinga ya nsinga (13). Ata nsuka ya monomere ti monomere kele na Rba. Dimere ya sphaéroïdes kele na kisika ya kukangama ya proteine ​​W na kati ya RC-LH114-W, mpe kisika ya kukangama yina PufX na proteine-W ke basisaka kele na kisika ya kufwanana (Kifwanisu S7A). Kuvanda na nzila ya RC-LH114-W ke wakana mpi ti nzila ya quinone (8) ya bo ke yindulaka nde yo kele ya mbi, yina ke salamaka na ba peptide yina ke wakana ve ti proteine ​​W to PufX (Kifwanisu S7B). Na zulu ya mambu yai, nzila ya kinone na Blc. LH1 ya vert émeraude yina me salama na kukatulaka kitini mosi ya γ (7) kele na kisika ya mutindu mosi (Kifwanisu S7C). Ata yo ke salamaka na nzila ya baproteine ​​ya kuswaswana, kumonana ya banzila yai ya quinone/kinolol na kisika mosi na kati ya kimvuka ya RC-LH1 ke monana bonso mbandu ya evolisio yina ke wakana, yo ke monisa nde kisika yina proteine ​​W ke salaka lenda sala bonso nzila ya quinone.
Kuvanda na kati ya nsinga ya LH114-W ke pesa nzila na kusala kisika mosi ya ke landa na kati ya kisika ya kati ya kimvuka ya RC-LH114-W ti nsinga ya nene (Kifwanisu 1G), na kisika ya kuvukisa bisika zole yina na nzila ya pore ya proteine ​​mutindu na ba proteine. RC-LH116 kele kiteso mosi ti Tch ya kukangama. Kusala mambu bonso ntunga (22) (Kifwanisu 1H). Sambu kumwangana ya quinone na nzila ya membrane ke vandaka nswalu kuluta kumwangana na nzila ya fioti ya proteine, nsinga ya LH114-W ya kukanguka lenda pesa nzila nde RC kubaluka nswalu kuluta nsinga ya LH116 ya kukangama, mpi kumwangana ya quinone na kati ya RC lenda vanda ti bandilu mingi. Na kumeka kana proteine ​​W ke na bupusi na kubalula ya ba quinones na nzila ya RC, beto salaka test ya kukangama ya ba quinones na zulu ya kifulu mosi ya ubiquinone 2 (UQ2) (kifwani ya UQ10 ya kimuntu yina kele na mukila ya nkufi ya isoprène) (Kifwanisu 2E). Ata kuvanda ya quinone chélée ke kangaka nzila na kuzaba mbote-mbote mambu yina ke monanaka nde yo ke vandaka kaka mutindu mosi (RC-LH114-W mpi RC-LH116 me fwana sambu na 0,2±0,1μM mpi 0,5±0,2μM, na kulandana), ntalu ya kuluta mingi ya s. 28±5% ya nene kuluta RC-LH116 (3,6±0,1 ya 1 s-1).
Na luyantiku, beto vandaka kuyindula nde proteine-W kele na kiteso ya 10% ya bima yina kele na kati (16); awa, ntalu ya bantu ke zingaka na ba cellule ya kukula ya nsemo ya fioti, ya kati-kati, mpe ya nsemo mingi kele 15±0,6%, 11±1% mpe 0,9±0,5, na kulandana % (Kifwanisu 2F). Kufwanisa ya ntalu ya spectrométrie ya masse monisaka ti kuyika tag ya histidine kulumusaka ve ntalu ya fioti ya ba proteine-W kana beto fwanisa yau na ba nzila ya mutindu ya mfinda (P = 0,59), yau yina ba niveau yayi kele ve kima ya kusadila ya proteine-W yina me soba (Kifwanisu S10). Kansi, kisika yai ya fioti ya proteine-W na kati ya kimvuka ya RC-LH1 lenda pesa nzila nde ba RC ya nkaka kubaluka nswalu, ebuna yo lenda kulumusa nsoba ya malembe ya ke salamaka na kimvuka ya RC-LH116. Beto monaka nde ntalu ya mingi ya bantu yina ke zingaka na nsemo ke wakana ve ti bansangu ya ntama ve ya ke tadila mambu yina bo me sonikaka, yina ke monisa nde mutindu ba gène ya pufW ke basikaka ke kumaka mingi na nsi ya nsemo ya ngolo (Kifwanisu S11) (23). Luswaswanu na kati ya kusonika pufW mpi kukotisa proteine-W na kati ya kimvuka ya RC-LH1 ke yangisaka bantu mpi yo lenda monisa mutindu ya mpasi yina proteine ​​ke twadisaka mambu.
Na kati ya RC-LH114-W, bo ke kabulaka mpi ke salaka mbandu na kati na yo ba CDL 6, ba POPC 2, ba POβDM 2 mpi ba 12. (Kifwanisu 5, A mpi B). Na kati ya bima zole yayi, CDL ke vuanda pene-pene na ndambu ya mvingu ya bantu, na ntangu yina POPC, POPG mpe β-DDM ke vuanda mingi na ndambu ya mvingu ya bantu. Bau katulaka ba molecule zole ya mafuta mpe ya kuyobisa na kizunga ya αβ-1 tii na αβ-6 ya kimvuka ya RC-LH114-W (Kifwanisu 5A), mpe tanu katukaka na kizunga ya kitezo mosi ya RC-LH116 (Kifwanisu 5B ). Bau monaka mafuta mingi na ndambu yankaka ya kimvuka, mingimingi CDL, yina mevukana na kati ya RC ti αβ-7 tii na αβ-13 (Kifwanisu 5, A ti B). Ba lipides ya nkaka mpe bima ya kuyobisa yina me bongisama na mutindu ya kutungama kele na nganda ya nsinga ya LH1, mpe ba nsinga ya acyl yina me bongisama mbote ke kwenda na kati ya ba unités ya fioti ya LH1, yina ba me pesa zina ya β-DDM na RC-LH114-W, mpe yina ba me pesa ntendula ya β-DDM na RC Kuvukisa ya βPOPC-DLDM mpe 6. Ba nzila ya mutindu mosi ya ba lipides chelates mpe ba détergents na kati ya ntungulu na beto ke monisa ti yau kele bisika ya kukangama yina kele na mfunu ya nzutu (Kifwanisu S12A). Bapozisio ya bamolekile ya kufwanana na Tch mpi kevandaka ti kuwakana ya mbote. Mawete na Trv. 970 RC-LH1s (Kifwanisu S12, B tii na E) (9, 12) mpi bima yina me bikala yina ke kangamaka na hydrogène ya kimvuka ya ntu ya mafuta monisaka kutanina ya mbote kibeni na ndonga ya ndonga (Kifwanisu S13), yina ke monisa nde CDL yina bo me bumbaka yina ke kangamaka na RC (24), bisika yai lenda vanda ti bima yina bo me bumbaka.
(A na B) Ba peptide ya RC-LH114-W (A) na RC-LH116 (B) me monisama na ba dessin animé, mpe ba pigments me monisama na ba nsinga, na kusadilaka nzila ya mukubu na kifwanisu 1. Ba lipides me monisama na mbwaki, mpe ba detergents me monisama na gris. UQ me kangama na bisika ya RC QA na QB kele ya jaune, na ntangu yina UQ ya kukabwana kele ya bleu. (C mpi D) Mabanza ya mutindu mosi ti (A) mpi (B), bo me katula mafuta ya nitu. (E tii na G) Kumona na nene ya Q1(E), Q2(F) mpi Q3(G) ya RC-LH116, ti minyololo ya balweka yina ke vandaka ti bupusi na kati na yo. Bo ke monisaka bangwisana ya hydrogène bonso banzila ya ndombe ya bo me tula bidimbu.
Na RC-LH116, RC QA mpe QB UQ, yina ke salaka kisalu ya kupesa ba électrons na nzila ya kukabula ba charges, ke bebaka na bisika yina ba ke kangamaka. Kasi, na RC-LH114-W, ba me manisa ve mambu ya QB mpe beto ke tubila yau na bunda na nsi. Na zulu ya ba quinones ya QA mpe ya QB, ba molecules zole ya UQ ya chelé (yina kele na kati ya ba nsinga ya RC mpe ya LH1) ke kabuanaka na kati ya ntungulu ya RC-LH114-W na kutadila bimvuka ya ba ntu na bau yina me bongisama mbote (yina kele na Q1 mpe Q2, na kulandana). mpwasa). Kifwanisu 5C). Ba unité zole ya isoprène me pesama na Q1, mpe carte ya densité ke manisa mikila 10 ya isoprène ya mvimba ya Q2. Na ntuala ya RC-LH116, ba nsangu tatu ya UQ10 ya kukangama (Q1 tii na Q3, kifwanisu 5D) me manisa, mpe ba nsangu nyonso kele na ngolo ya pwelele na mukila nyonso (Kifwanisu 5, D tii na G). Na ba ntuadisi zole, bisika ya bimvuka ya ntu ya quinone ya Q1 na Q2 kele na nguizani ya mbote (Kifwanisu S12F), mpe yau ke sala kaka na RC. Q1 kele na kikotilu ya nzila ya W ya RC-LH114-W (Kifwanisu 1G na 5, C, D na E), mpe Q2 kele pene-pene ya kisika ya kukangama ya QB (Kifwanisu 5, C, D) na F). Ba nsangu ya L-Trp143 na L-Trp269 yina me bumbana kele pene-pene mingi na Q1 na Q2 mpe ke pesa ba nzila ya kuvukisa π (Kifwanisu 5, E na F, na Kifwanisu S12). L-Gln88, 3,0 Å katuka na mupepe ya ntama ya Q1, ke pesaka nsinga ya ngolo ya masa (Kifwanisu 5E); résidu yayi ke bumbanaka na ba RC nyonso katula kaka nguizani yina kele ntama mingi (Kifwanisu S13). L-Ser91 ke tambulaka na kisika ya Thr na mutindu ya kutanina na ba RC mingi ya nkaka (Kifwanisu S13), kele 3,8 angstrom katuka na oxygène méthylique ya Q1, mpe lenda pesa ba nsinga ya hydrogène ya kulemba (Kifwanisu 5E). Q3 ke monana ve na nguizani mosi ya sikisiki, kansi yau kele na kizunga ya masa na kati ya kitini ya RC-M na kitini ya LH1-α 5 tii na 6 (Kifwanisu 5, D na G). Q1, Q2 na Q3 to ba nsinga ya kukangama ya pene-pene me manisa mpi na Tch. Mawete, Trv. Mutindu 970 na Blc. Kutunga ya iris (9, 10, 12) ke monisa kisika mosi ya bo me bumbaka ya ke vukisaka bima ya ke sadisaka na kukangama na kati ya kimvuka ya RC-LH1 (Kifwanisu S12G). Ba UQ tanu ya kubeba na RC-LH116 ke wakana mbote na 5,8±0,7 ya konso kimvuka yina me zabana na nzila ya chromatographie ya masa ya ngolo (HPLC), na ntangu yina ba UQ tatu ya kubeba na RC-LH114-W kele na nsi ya Ntalu ya kutesa ya 6,2±0,3 ke monisa nde bamolekile ya 6,2±0,3 kele (Kifwanisu. kima.
Ba polypeptide L na M ya luvunu ke vandaka ti ba TMH tanu mpi ke salaka hétérodimere yina ke vukisaka dimere mosi ya BChl, ba monomère zole ya BChl, ba monomère zole ya bamikrobe (BPh), mpi kibende mosi ya kele ve Heme mpi mosi to ba molecule zole ya UQ10. Na nzila ya kuvanda ya bangwisana ya hydrogène na kimvuka ya ba cétone ya nsuka mpi ya kuvukisa na yo ya mezabanaka na Rps, ba caroténoïdes kekotaka na kati ya kitini ya M, yina bo kebingaka cis-3,4-déhydroorhodopine. Bifwanisu (25). Domaine ya nganda ya RC-H ke kangamaka na TMH mosi mpamba. Lupangu ya RC ya mvimba kele kiteso mosi ti ba unité tatu ya RC ya mitindu ya ke wakana (bonso Rba). nsusu (ID ya PDB: 3I4D). Ba nzila ya nene ya BChl na BPh, mukongo ya caroténoïde na kibende yina kele ve ya héme ke kutana na kati ya bandilu ya ba nzila yayi, mutindu mosi na kimvuka ya ntu ya UQ10 na kifulu ya QA na kinone ya QB na RC-LH116 (Kifwanisu S15).
Kuvanda ya ba ntungulu zole ya RC na ba ntalu ya kuzinga ya bisika ya QB ya kuswaswana ke pesa dibaku ya mpa ya kutadila bansoba ya ke landanaka ya ke kwendaka nzila mosi ti kukangama ya quinone ya QB. Na kati ya kimvuka ya RC-LH116, quinone QB kele na kisika ya “pene-pene” ya kukangama mbote-mbote (26), kansi kukabwana ya RC-LH114-W kele ve ti quinone QB. 114-W kele ve ti kima mosi ya ke yitukisaka sambu kimvuka yango ke salaka, kuluta kimvuka ya RC-LH116 yina kele ti kima ya nkaka ya ke sadisaka na kuyidika mambu. Ata ba-anneau zole ya LH1 ke vukisaka kiteso ya ba-quinone sambanu, tanu ke vandaka ti bandilu na mutindu ya kutunga na ba-anneau RC-LH116 ya kukangama, kansi kaka tatu ke vandaka ti bandilu na mutindu ya kutunga na ba-anneau RC-LH114-W ya kukanguka . Kukonda kuwakana yai ya ke kuma mingi lenda monisa nde bo ke yingisa nswalu bisika ya RC-LH114-W QB, mutindu bo ke salaka mambu nswalu na kati ya kimvuka yina, mpi nde bantu ke vandaka ti mabaku mingi ya kusabuka nzila ya LH1. Beto ke tuba ti kukonda ya UQ na kifulu ya RC QB ya RC-LH114-W lenda vuanda mbutu ya kifulu ya kulutila ngolo mpe ya kusala mingi, mpe kisika ya QB ya RC-LH114-W me kangama mbala mosi na kati ya mvingu ya bantu na UQ Etape ya sikisiki (kukota na kifulu ya QB me kangama) ref.
Kana QB kele ve, kubaluka ya L-Phe217 yina ke kwendaka nzila mosi na kisika yina ke wakana ve ti kukangama ya UQ10, sambu yo ta sala nde kisika kukutana ti unité ya isoprène ya ntete ya mukila (Kifwanisu 6A). Na zulu ya mambu yina, bansoba ya nene ya ke monana pwelele ya ke monanaka pwelele, mingi-mingi hélice de (hélice ya nkufi na kati ya nsinga yina kele na kati ya TMH D mpi E) kisika L-Phe217 ke balukaka na poshi ya kukangama ya QB mpi kubaluka ya L-Tyr223 (Kifwanisu 6A ) Sambu na kuzenga nsinga ya hydrogène ti kadre ya kukangama ya QB mpi ya kukangama ya M-4. kisika (Kifwanisu 6B). Hélice ya ke balukaka na nsi na yo, Cα ya L-Ser209 ke balukaka na 0,33Å, kansi L-Val221Cα ke balukaka na 3,52Å. Kuvanda ve na ba nsobolo ya kumonana na TMH D na E, yina kele na zulu ya bima nyonso zole (Kifwanisu 6A). Na mutindu beto me zaba, yayi kele ntungulu ya ntete na kati ya RC ya kimuntu yina ke kangaka kisika ya QB. Kufwanisa na ntungulu ya mvimba (yina mekangama na QB) kemonisa nde na ntwala nde bo kulumusa ntalu ya kinsuni, yo kelombaka kusoba mutindu ya kutunga sambu na kusala nde yo kota na kati ya kinsuni. L-Phe217 ke balukaka sambu na kusala kuwakana ya π-kukangama ti kimvuka ya ntu ya quinone, mpi hélice ke balukaka na nganda, ebuna yo ke pesaka nzila na ntu ya L-Gly222 mpi na nsinga ya lweka ya L-Tyr223 na kusala réseau ya nsinga ya masa yina kele ti ngidika ya nsinga ya masa yina ke kangamaka ngolo (Kifwanisu 6, A mpi C).
(A) Dessin animé ya ke landanaka ya holograme (nsinga ya L, ya nsinga ya orange/M, ya mbwaki-ble) mpi ya apo (ya gris), yina bo ke monisaka bima ya mfunu yina me bikala na mutindu ya kifwanisu yina kele bonso nti. UQ10 ke monisama na barre ya jaune. Line ya matonsi ke monisa bangwisana ya hydrogène yina me salamaka na kati ya ngidika ya mvimba. (B mpi C) Kifwanisu ya zulu ya proteine ​​yina ke fwaka nitu mpi ya ngidika ya mvimba ya ba-anneau, yina ke monisa mbote-mbote mupepe ya ke vandaka na lweka ya L-Phe217 na langi ya bleu mpi L-Tyr223 na langi ya mbwaki. Kitini ya L kele ya langi; ba unités ya fioti ya M mpi ya H kele ve ti mukubu. (D na E) Bisika ya RC QB (D) mpe ya mvimba (E) [kupesa mukubu na (A) na kulandana] mpe PSII (ya mbwaki, ya mbwaki na quinone ya plastique; ID ya PDB: 3WU2) Tula na ndonga (58).
Na mutindu ya kukonda kuyindula, ata ba ntungulu mingi ya ba RC ya kukonda QB ya kukonda LH1 kele, bansoba ya mutindu ya kutunga yina me monana na kulonguka yai me zabisama ntete ve. Yau ke tadila ngidika ya kumanisa QB katuka na Blc. (27), Tala. (28) mpi Rba. (29), yina yonso kele pene-pene ya mutindu mosi ti ngidika na yo ya mvimba ya QB. Kutala mbote-mbote 3PRC monisaka nde bamolekile ya LDAO (Oxyde d’amine d’amine de lauryl) ke kangamaka na kikotilu ya kisika ya QB, yina lenda kanga nzila na kuyidika diaka mambu na mutindu mosi ya kukangama. Ata LDAO ke bebaka ve na kifulu mosi na 1EYS to 1OGV, ba RC yayi ke bongisamaka na kusadilaka nkisi mosi ya kuyobisa mpe yau lenda buta mbutu ya mutindu mosi. Kusala ya kristale ya Rba. 1L9B) ke monana mpi nde yo kele ti kisika ya QB ya kukangama. Kansi, na mutindu yai, kisika ya nsuka ya N ya polypeptide RC-M (yina ke vukanaka ti kisika ya kukangama ya QB na nzila ya nsinga ya H ya bima ya Tyr yina me bikala na zulu ya hélice Q) ke bakaka mutindu mosi ya kukonda kimuntu, mpi nsoba ya mutindu ya QB ke sosamaka diaka ve (30 ). Kima ya ke pesa kikesa kele nde beto me monaka ve mutindu yai ya kubeba ya polypeptide M na ngidika ya RC-LH114-W, yina kele pene-pene ya kisika ya nsuka ya N ya RC-LH116 RC. Yau fuana zaba diaka ti na manima ya kukatula antene ya LH1 yina kele na ntuala ya bima ya kuyobisa, ba RC ya apolipoprotéine na kati ya PDB manisaka, yina katulaka ba masa ya quinone ya kati mpe ba lipides na kati ya kisika yina kele na kati ya RC mpe kisika ya kati ya nsinga ya LH1 yina kele na nziunga (31, 32). RC ke bikalaka na kisalu sambu yau ke bumbaka bima yonso ya ke sadisaka, katula kaka quinone QB yina ke bebaka, yina ke vandaka ngolo ve mpi mbala mingi yo ke vilaka ntangu bo ke yidikaka yo (33). Na zulu ya mambu yina, yau mezabana nde kukatula LH1 ti mafuta ya nziunga ya kimuntu na RC lenda vanda na bupusi na bisalu, bonso kufiotuna luzingu ya P+QB-état ya kukabwana ti charge (31, 34, 35). Na yina, beto ke banza ti kuvanda ya nsinga ya LH1 ya kisika yina kele na nziunga ya RC lenda tanina kisika ya QB ya “kukangama”, na mutindu yina kutanina kisika ya kisika yina kele pene-pene ya QB.
Ata apolipoprotéine (ya kukonda quinone QB) mpe ntungulu ya mvimba ke monisa kaka bafoto zole ya mvingu ya kisika ya QB, na kifulu ya kulandana ya mambu, kele na mambu ke monisa ti kukangama lenda kangama samu na kukanga nzila na kukangama diaka na nzila ya hydroquinone Samu na kukanga nzila na kukangama ya ntoto. Kusalasana ya quinolol na quinone pene-pene ya kisika ya QB ya apolipoprotéine lenda vanda ya kuswaswana, yina ke nata na kubuya yau na RC. Bau ke tubaka banda ntama nde bansoba ya mutindu ya kutunga ke salaka kisalu na kukangama mpi na kukulumusa ba quinones. Makoki ya ba RC ya kukangama na kukulumusa ba quinones na nima ya kuyikana ti mpimpa ke bebaka (36); 10:10, 11. 10 Ke monisa nde kubeba yai me katuka na mutindu ba quinone ya QB me kangama na kisika mosi ya “ntama” kiteso ya 4,5 Å katuka na kisika ya pene-pene yina ke salaka (26) , 37). Beto ke tuba nde mutindu yai ya kukangama ya ntama kele kifwanisu ya kisika ya kati-kati ya apolipoprotéine mpi ngidika ya mvimba ya bague, yina ke landaka kuwakana ya ntete ti quinone mpi kukangula ya kisika ya QB.
Mutindu ya II ya RC yina ke monanaka na kati ya kimvuka ya PSII ya ba bactérie ya nkaka ya ke diaka ntangu na ba bactérie ya cyano, ba algues na ba yinti kele na lutaninu ya ntungulu mpe ya bisalu (38). Kubongisa ya ntungulu yina me monisama na kifwanisu 6 (D na E) ke tubila mingi mutindu mosi na kati ya ba RC ya PSII na kisika ya QB ya kimvuka ya ba RC ya bactérie. Kufwanisa yai mekumaka banda ntama mbandu ya kulonguka mutindu ya kukangama mpi ya kukulumusa quinone yina kele na kuwakana ya ngolo. Mikanda ya ntama vandaka kutuba nde bansoba ya mutindu ya kutunga kekwendaka nzila mosi ti kukulumusa ya PSII ya ba quinones ( 39, 40 ). Na yina, kana beto tala mutindu ya kutanina RC na nzila ya evolisio, mutindu yayi ya kukangama yina ba monaka ntete ve lenda mpe kusadila na kifulu ya QB ya PSII RC na ba yinti yina ke diaka oxygène.
Rps ΔpufW (kukatula ya pufW ya kukonda kidimbu) mpi ya PufW-His (proteine-W ya kele ti kidimbu ya C ya nsuka ya 10x yina bo me basisa na kisika ya pufW ya kimuntu). CGA009 yina bo tubilaka na kisalu na beto ya ntama (16). Ba nsinga yayi mpe kibuti ya mutindu ya mfinda ya isogène bakamaka na kati ya congelateur na kutulaka ba nzila ya fioti na zulu ya PYE (konso 5 g ya litre -1) (yina me bumbana na LB na -80 °C, yina kele na 50% ( p/v) ya proteine ​​ya glycérol, ya bima ya levire mpe ya agar [15]. Bau tulaka plaque yina na mpimpa ya mvimba na mpimpa na tiya ya kisika yina mupepe kele ve, na nima bau tulaka yau na nsemo ya mpembe (~50 μmolm-2 s-1) yina ba ampoules halogènes 116-W ya OSRAM (Bima ya RS, Royaume-Uni) pesaka na nsungi ya bilumbu 3 tii na 5 tii kuna kimvuka mosi ya bambisi basikaka. Bau sadilaka kimvuka mosi samu na kutula ml 10 ya mvingu ya bantu (41) yina ba me yika na 0,1% (p/v) ya ba acides cazamino (na nima beto ke bokila yau M22). Bau ke kunaka mbuma na kisika ya oxygène fioti na mpimpa na 34°C na kunikisa na 180 rpm na bangunga 48, na nima bau ke tulaka 70 ml ya mbuma na kisika ya mutindu mosi na bangunga 24. Bau kesadilaka culture semi-aérobie na volime ya 1 ml samu na kutula 30 ml ya masa ya M22 na kati ya mulangi ya 30 ml ya bima ya mvimba yina kele na zulu ya vis mpe bau ketulaka yau na nsemo ya mvingu ya bantu (~50 μmolm-2 s-1) na bangunga 48 na ngolo ya mvingu ya bantu ya kukonda kubuta. Na nima 30 ml ya mvingu ya bantu me tulama na kitezo ya litre 1 ya mvingu ya bantu na mutindu mosi, yina na nima ba me sadila samu na kutula kitezo ya litre 9 ya mvingu ya bantu me pesa nsemo na ~200 μmolm-2 s-1 na bangunga 72. Bau me katula ba cellules na nzila ya mvingu ya bantu na 7132 RCF na miniti 30, bau me vutula yau na ~10 ml ya tris-HCl 20 mM (pH 8,0), mpe bau me bumba yau na -20°C tii kuna bau ke lomba yau.
Na nima ya kuyoka, yika mwa bakristale ya déoxyribonucléase I (Merck, Royaume-Uni), ya lysozyme (Merck, na Royaume-Uni) mpi bima zole ya ke kangaka masa na baselile yina bo me vutula na masa. Na selile mosi ya France yina vandaka ti ngolo ya 20 000 psi (Aminco, na États-Unis), bo vandaka kufwa baselile yina mbala 8 tii na 12. Na nima ya kukatula baselile yina me bukana ve mpi bima yina ke lembaka ve na nzila ya kuyoka yo na 18 500 RCF na nsungi ya miniti 15 na 4°C, bo katulaka membrane yina na zulu ya lysate yina vandaka ti mukubu na nzila ya kuyoka yo na 113 000 RCF na nsungi ya bangunga 2 na 43 000°C. Katula kitini ya ke lembaka mpi tula diaka nsinga ya mukubu na kati ya ml 100 tii na 200 ya tris-HCl 20 mM (pH 8,0) mpi sala nde yo vanda mutindu mosi tii kuna bima ya ke monanaka ve ta vanda diaka ve. Bau tulaka nsinga ya kukangama na kati ya nsinga ya 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, États-Unis) yina kele na 2% (p/v) ya β-DDM na ngunga 1 na mpimpa na 4°C na kunikisa yau na mawete. Na nima, tula yo na 70°C sambu na kuyoka RCF 150 000 na 4°C na nsungi ya ngunga 1 sambu na kukatula bima yina me bikala yina ke yokaka ve.
Bau tulaka nsinga ya kuyoka yina mekatuka na nsinga ya ΔpufW na zulu ya nsinga ya kubalula ba ion ya DEAE ya 50 ml ti ba volime ya nsinga tatu (CV) ya tampon ya kukangama [20 mM ya tris-HCl (pH 8,0) yina kele na 0,03% (p/v) ya β-DDM]. Kuyobisa nzungu na ba tampon zole ya kukangama ya CV, na nima kusukula nzungu na ba tampon zole ya kukangama yina kele na NaCl 50 mM. Bau katulaka kimvuka ya RC-LH116 na nzila ya nzila mosi ya NaCl 150 tii na 300 mM (na tampon ya kukangama) na 1,75 CV, mpe kimvuka ya kukangama yina bikalaka katukaka na tampon ya kukangama yina kele na NaCl 300 mM na 0,5 CV. Kuvukisa nzila ya kukangama na kati ya 250 na 1000 nm, kubumba kitini ya kele na ntalu ya kukangama (A880/A280) kuluta 1 na 880 na 280 nm, kuyoka yau mbala zole na tampon ya kukangama, mpe kusadila mutindu mosi diaka na zulu ya nzila ya DEAE Na zulu ya kusukula. Kudilusa bitini yina kele na ntalu ya A880/A280 kuluta 1,7 mpe ntalu ya A880/A805 kuluta 3,0, kusala nziunga ya tatu ya kusoba ba ion, mpe kubumba bitini yina kele na ntalu ya A880/A280 kuluta 2,2 mpe ntalu ya A880/A805 kuluta.0. 100 000 kilo ya molecule ya Amicon (Merck, Royaume-Uni), mpi bo tulaka yo na zulu ya colonne ya kukatula ya nene ya Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, États-Unis) yina kele ti tampon ya NaC na 200 m, 1,5 CV. Kuvukisa ba nzila ya kuzwa masa ya kitini ya nene ya kukatula, mpe kuvukisa ba nzila ya kukangama na ba ntalu ya A880/A280 na zulu ya 2,4 mpe ba nzila ya A880/A805 na zulu ya 5,8 tii na 100 A880, mpe sadila yau mbala mosi samu na kubongisa to kubumba grille ya cryo-TEM na nsatu Kubumba na -C°0.
Bau tulaka nsinga ya kuyobisa yina me katuka na mvingu ya bantu na zulu ya 20 ml ya mvingu ya bantu (20 mM ya tris-HCl (pH 8,0) yina kele na 200 mM ya NaCl mpe 0,03% (p/p)) na kati ya tampon ya IMAC ya mavimpi ( GE). v) β-DDM]. Bau sukulaka koloni na ba CV tanu ya tampon ya IMAC, na nima na ba CV tanu ya tampon ya IMAC yina kele na histidine 10 mM. Bau katulaka kimvuka ya kati na kati ya ntuala na ba tampon tanu ya IMAC yina kele na 100 mM ya histidine. 000 MWCO (Merck, Royaume-Uni), bo ke vukisaka yo mbala 20 ti tampon ya ke vukisaka masa, mpi na nima bo ke yikaka yo na 25 ml ya masa yina bo ke sadilaka sambu na kuvukisa masa. na ntwala. Sukula koloni na ba tampon iya ya kukangama ya CV, na nima katula kimvuka na ba CV nana na zulu ya nzila ya 0 tii na 100 mM ya NaCl (na tampon ya kukangama), mpe ba CV iya yina me bikala kele na 100 mM ya tampon ya kukangama Ba bima ya kukangama yina me bikala me katuka na kimvuka ya A8A20. 100 000 MWCO, mpi bo fulusaka yo ti 1,5 CV IMAC na ntwala. 1,5 CV. Kuvukisa ba nzila ya kuzwa masa ya bitini ya nene-kukatula mpe kuvukisa ba nzila ya kubaka masa na ba nzila ya A880/A280 na zulu ya 2,1 mpe ba nzila ya A880/A805 na zulu ya 4,6 tii na 100 A880, yina ke sadilamaka mbala mosi samu na kubongisa grille TEM ya kukangama to kubumba yau tii na mfunu ya -80°C.
Bo sadilaka congelateur mosi ya bo ke bingaka Leica EM GP sambu na kuyidika ba grilles TEM ya tiya fioti. Bau tulaka kimvuka yina na kati ya tampon IMAC tii na A880 ya 50, na nima bau tulaka 5μl na zulu ya nsinga ya cuivre ya mpa ya ke sema yina me fuluka ti carbone (Agar Scientific, Royaume-Uni). Kuyoka grille na 20°C mpe 60% ya mvula na 30 s, na manima kuyobisa yau na 3 s, mpe na manima kufwa yau na éthanol ya masa na -176°C.
Bau sonikaka bansangu ya kimvuka ya RC-LH114-W na eBIC (Centre électronique de bioimagerie) (Kisika ya Nsemo ya Diama ya Grande-Bretagne) ti mikroskope ya Titan Krios, yina kesalaka na vitesi ya 300kV, ti ngolo ya kukumisa nene ya zina ya Choose ya 130 000 ya-2× mpi ya ngolo ya 130 000 ya e. Bau sadilaka GIF ya Gatan 968 yina kele na kisadilu ya kuzaba zulu ya K2 samu na kusonika bifwanisu na mutindu ya kutanga samu na kuzwa bansangu. Bunene ya bifwanisu yina bo me yidika kele 1,048Å, mpi ntalu ya dose kele 3,83 e-Å-2s-1. Yandi vukisaka filme yina na basegonde 11 mpi yandi kabulaka yo na bitini 40. Sadila kisika yina bo me tula carbone sambu na kutula diaka dikebi na mikroskope, mpi na nima vukisa bafilme tatu na konso dibulu. Na kimvuka, ba filme 3130 me vukana, na ba ntalu ya kukonda kukangama na kati ya -1 na -3μm.
Bau vukisaka bansangu ya kimvuka ya RC-LH116 na kusadilaka mikroskope mosi na Laboratoire ya Biostructure ya Asterbury (Iniversite ya Leeds, na Royaume-Uni). Bau vukisaka bansangu na mutindu ya kutanga na kukumisa nene 130 k, mpe bau tulaka nene ya ba pixel na 1,065 Å na dose ya 4,6 e-Å-2s-1. Bo sonikaka filme yina na basegonde 12 mpi bo kabulaka yo na bitini 48. Na kimvuka, ba filme 3359 me vukana, na ba ntalu ya kukonda kukangama na kati ya -1 na -3μm.
Kubongisa bansangu nyonso ke salama na kati ya nzila ya Relion 3.0 (42). Sadila Mupepe 2 (43) samu na kubongisa muvema ya nsinga na nzila ya kupesa kilo ya dose, mpe na manima sadila CTFFIND 4.1 (44) samu na kuzaba parametre ya CTF (fonction de transfert de contraste). Ba foto ya fioti ya kifwani na nima ya ba nzila yayi ya ntete ya kusadila me monisama na kifwanisu 2. S16. Mutindu ya kupona ya automatique ke basikaka na kuponaka na maboko kiteso ya ba pixel 250 ya ba pixel 1000 na kati ya kadre ya ba pixel 250 mpe ata ndonga mosi ve ya referansi ya bima zole (2D), na mutindu yina kubuya ndonga yina ke lungisaka mvindu ya mbandu to yina kele ve na bikalulu ya kumonana. Na nima, bo ponaka mambu na mutindu mosi ya kukonda kuyindula na bafoto yonso ya fioti-fioti, mpi RC-LH114-W vandaka ti bima 849 359, mpi bima 476 547 yina vandaka na kimvuka ya RC-LH116. Ba nsangu nyonso ya kuponama me luta na ba nzietolo zole ya ku tula na ndonga ya 2D yina kele ve na kulandana, mpe na manima ya konso nzietolo, ba nsangu yina ke kutana na kizunga ya carbone, mvindu ya mbandu, ata kima mosi ve ya ke monana to bima yina ke landanaka ngolo, ba ke buyaka yau, yau ke sala ti ba nsangu 772.033 (90,9%) mpe 359.678% ya nsangu kele3d. RC-LH114-W mpi RC-LH116 na kulandana. Bau salaka ba mbandu ya ntete ya 3D na kusadilaka metode ya kukulumuka ya stokasti. Na kusadilaka mbandu ya ntete bonso kifwani, bo ke kabulaka bima yina bo me pona na bitini iya na 3D. Na kusadilaka mbandu yina kele na ndonga yai bonso kifwani, sala 3D ya kutomisa na zulu ya bima yina kele na ndonga ya kuluta nene, na nima sadila filtre ya ntete ya 15Å ya ke lutaka na nsi sambu na kufika kisika ya solvant, yika bapixel 6 ya balweka ya petepete, mpi sala na nima ya kusala bapixel sambu na kusungika kisalu ya kukatula ya Gatan K2 ya zulu ya Mo. Samu na kimvuka ya ba nsangu ya RC-LH114-W, mbandu yayi ya ntete me sobama na kukatulaka mvingu ya ngolo na ba nsuka ya masque (kukatuka na mvingu ya bantu ya ngolo na kati ya Chimère ya UCSF). Ba mbandu yina me basika (ba résolution ya RC-LH114-W mpe RC-LH116 kele 3,91 mpe 4,16 Å, na kulandana) me sadilama mutindu nzila ya kusadila samu na nziunga ya zole ya kukabula 3D. Ba bima yina ba ke sadilaka ke vukisamaka na kitini ya ntete ya 3D mpe ke vuanda ve na nguizani ya ngolo na kartie. Kuvukisa to kukonda bikalulu ya pwelele ya ngidika. Na nima ya nziunga ya zole ya ku tula na ndonga ya 3D, ba ponaka ndonga yina kele na résolution ya kuluta nene [Sambu na RC-LH114-W, ndonga mosi kele ba ndambu 377 703 (44,5%), samu na RC-LH116, kele na ba ndonga zole, na kimvuka kaka ba ndambu 260 752 kele. na nima ya kubaluka ya ntete ti luswaswanu ya fyoti]. Bo ke basisaka diaka bima yina bo me pona na kati ya kesi ya kele ti bapixel 400 mpi bo ke kumisaka yo mbote na nzila ya 3D. Maske ya solvant ke basikaka na kusadilaka filtre ya ntete ya 15Å ya ke lutaka na nsi, kukula ya karte ya bapixel 3 mpi maske ya petepete ya bapixel 3. Na kusadilaka kubongisa CTF na konso kitini, kubongisa muvema ya konso kitini na nziunga ya zole ya kubongisa CTF na konso kitini, kubongisa 3D, kufika na solvant mpe kusala na nima ya kisalu ke salama na manima ya konso kitambi samu na kubongisa diaka ntungulu yina ke basika. Na kusadilaka ntalu ya kuzenga ya FSC (Coéfficient de corrélation de la coque de Fourier) ya 0,143, ba nsikudukusu ya ba mbandu ya nsuka ya RC-LH114-W mpe RC-LH116 kele 2,65 mpe 2,80Å, na kulandana. Kubongisa ya FSC ya mbandu ya nsuka me monisama na kifwanisu 2. S17.
Bau ke bakaka ndonga ya baproteine ​​yonso na nzila ya ordinatere; LH1-α (PufA; Kifwanisu ya Kifwanisu: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID ya muntu mosi: O83005); RC-M (PufM; ID ya Prot mosi: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID ya Kisalu: A0A4Z9); Protéine-W (PufW; ID ya Proteine ​​mosi: Q6N1K3). Ba sadilaka modele ya SUIS (45) samu na kutunga modele ya mutindu mosi ya RC, yina kele na ba ndonga ya ba proteine ​​ya RC-L, RC-M mpe RC-H mpe ntungulu ya kristale ya Rba. RC ya bo sadilaka bonso mbandu (ID PDB: 5LSE) (46). Sadila kisadilu ya “kufwanisa karte” na Chimera ya UCSF sambu na kufwanisa mbandu yina bo me basisa ti karte (47), kutomisa mutindu ya kutunga baproteine, mpi kima yina ke sadisaka [4×BChl a (zina ya bima ya me bikala na biblioteke ya monomere = BCL), 2×BPh a (BPH), mutindu mosi to zole ya UQ10 (U10), mosi (iFme) mpi mosi ya kele ve heme . 3,4-di-hidrohexakarbonilkoline (QAK)] sadila Coot (48) sambu na kuyika. Sambu QAK kele ve na biblioteke ya ba monomere, bo salaka yo na nzila ya kisadilu eLBOW na PHENIX (49).
Na nima, bo tungaka kitini ya fioti ya LH1. Na luyantiku, kisadilu ya kutunga yina ke salamaka na mbala mosi na PHENIX (49) sadilaka samu na kutunga na mbala mosi kitini ya ndonga ya LH1 na kusadilaka mukanda mpe ndonga ya ba proteine ​​LH1-α mpe LH1-β mutindu kima ya kukotisa. Pona kitini ya LH1 ya kuluta mvimba, basisa yau mpe tula yau na kati ya Coot, yika na maboko ndonga yina me konda na kati na yau, mpe na maboko tomisa ntungulu nyonso na ntwala ya kuyika BCl zole a (BCL) mpe mosi ya nsunga (CRT) [na kulandaka Rps ya kufwanana Densité ya kimvuka ya LH1 mpe yina me zabana. Bifwanisu (17)]. Kopia kitini ya LH1 ya mvimba, mpe sadila “Kisadilu ya Karte ya Kukangama” ya Chimère ya UCSF samu na kukangama na kisika ya pene-pene yina kele ve mbandu ya ntalu ya LH1, mpe na manima kubongisa yau na Coot; vutukila mambu yina tii kuna bo ta sala mbandu ya ba-unité yonso ya LH1. Samu na ntungulu ya RC-LH114-W, na kukatulaka ntalu ya bantu yina me kabuana ve na kati ya Coot, ba ke kabulaka ba mbuma na bima yina me bikala yina kele ve ba mbuma na kati ya mukanda ya USCF mpe ba ke sadilaka kisadilu ya Autobuild samu na kutula mbandu ya ntete, mpe ba ndambu ya fioti yina me bikala (proteine-W) Kusala mbandu. Na FENIS (49). Yika konso ndonga yina me konda na mbandu yina me basika na Coot (48), mpi na nima yidika na maboko kitini ya mvimba. Kukangama ya me bikala ya kukonda kukabula ke fwanana ti kimvuka ya mafuta (ID ya biblioteke ya monomere ya PDB ya CDL = CDL, POPC = 6PL mpi POPG = PGT), bima ya kuyobisa ya β-DDM (LMT) mpi ya UQ10 (U10). Sadila PHENIX ya kubongisa (49) mpe kubongisa ya maboko na Coot (48) samu na kubongisa mbandu ya luyantiku ya mvimba tii kuna ba ntalu ya mbandu mpe kikalulu ya kumona ya kufwanana lenda kutomisa diaka ve. Na nsuka, sadila LocScale (50) samu na kutomisa karte ya kisika, mpe na manima sala ba nzietolo mingi ya nkaka ya ku modeler ntalu ya bantu yina me kabuana ve mpe ku yidika mambu na mutindu mosi mpe na maboko.
Ba peptides, ba cofacteurs na ba lipides na ba quinones ya nkaka yina me kangama na kati ya ba ntalu na bau me monisama na bifwanisu 1 na 2. S18 tii na S23. Ba nsangu ya ntalu ya mbandu ya nsuka me monisama na Tableau S1.
Katula kaka kana ba me monisa mutindu ya nkaka, ba nsangu ya mvingu ya bantu me vukisama na zulu ya mvingu ya bantu na nzila ya 1 nm banda na 250 nm tii na 1000 nm mpe ntangu ya kuvukisa ya 0,1s.
Kuyoka mbandu na kati ya kitunga ya quartz na nzila ya 2 mm na A880 ya 1, mpe kuvukisa nzila ya kuzwa masa na kati ya 400 na 1000 nm. Bau vukisaka ba nzila ya mvingu ya bantu na nzila ya mvingu ya bantu na nzila ya 1 nm na kati ya 400 nm na 950 nm na vitesi ya 20 nm min-1.
Kufwa ya molar ke zabanaka na kuyobisaka kimvuka ya kati na A880 ya kitezo ya 50. Kuyobisaka volime ya 10μl na 990μl ya tampon ya kukangama to ya methanol, mpe kuvukisa mbala mosi spectre ya kubaka masa samu na kufiongunina kubeba ya BChl. Bau me tanga ntalu ya BChl ya konso mbandu ya metanol na nzila ya ntalu ya kufwa na 771 nm ya 54,8 mM-1 cm-1, mpe bau me zaba ntalu ya kufwa (51). Kabisa kitezo ya BChl yina ba me teza na 32 (RC-LH114-W) to 36 (RC-LH116) samu na kuzaba kitezo ya bima ya kati, yina na manima ba ke sadila samu na kuzaba kitezo ya kuzwa masa ya mbandu mosi yina ba me vukisa na kati ya tampon Coefficient ya kufwa. kutalana. Bau bakaka ba mesure tatu ya mbala na mbala samu na konso mbandu, mpe bau sadilaka mwayene ya mvingu ya bantu ya BChl Qy samu na kuzaba. Kufwa ya RC-LH114-W yina bo me tesaka na 878 nm kele 3280±140 mM-1 cm-1, kansi ntalu ya kufwa ya RC-LH116 yina bo me tesaka na 880 nm kele 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 me salama na kulanda mutindu ya kele na (52). Na bunkufi, bo salaka HPLC ya ke balukaka na nima (RP-HPLC) na kusadilaka ngidika ya HPLC 1200 ya Agilent. Kuyoka kiteso ya 0,02 nmol ya RC-LH116 to RC-LH114-W na 50μl ya methanol:chloroforme 50:50 yina kele na 0,02% (p/v) ya chlorure de fer, mpi kutula nmol ya Beckman Coulter yina bo me yidika na ntwala na kati ya m1. 40°C na zulu ya ntungulu ya ×25 cm. Kusala mvingu ya bantu na kati ya mvingu ya bantu samu na kutala mvingu ya bantu na 275 nm (UQ10), 450 nm (ba caroténoïdes) mpe 780 nm (BChl) na ngunga 1. Bo kotisaka nsongi ya 275 nm na miniti 25,5, yina vandaka ve ti bima ya nkaka yina bo lenda mona. Kisika ya kuvukisa ke sadilama samu na kuzaba ntalu ya molaire ya UQ10 yina me katuka na kutalaka nzila ya etalonnage yina me salama na nzila ya kutula ba nsiku ya mpembe banda na 0 tii na 5,8 nmol (Kifwanisu S14). Konso mbandu ba fimpaka yau na ba mbala tatu, mpe kifu yina ba pesaka rapore ke fwanana na SD ya mwayene.
Bau yidikaka ngidika mosi ya kele na kimvuka ya RC-LH1 yina kele na ngolo ya kubaka Qy ya kuluta mingi ya 0,1 ti 30 μM ya ntima ya mpunda ya bo me kulumusa (Merck, Royaume-Uni) mpi 0 tii na 50 μMUQ2 (Merck, Royaume-Uni). Ba échantillons tatu ya 1-ml me bongisama na konso ntalu ya UQ2 mpe ba me tula yau na mpimpa na mpimpa na 4°C samu na kuzaba kana yau me fwanana mbote na mpimpa na ntwala ya kutesa. Bau tulaka nsinga yina na kati ya spectrophotomètre modulaire ya OLIS RSM1000 yina kele na nzila ya 300 nm ya tiya/500 ya nzila, 1,24 mm ya kukota, 0,12 mm ya kati-kati mpe 0,6 mm ya kubasika. Bau ketulaka filtre ya kuluta ya nda ya 600 nm na kikotilu ya foto ya mbandu mpe foto ya referansi samu na kukatula nsemo ya kupesa kikesa. Bau ke landaka kukangama na 550 nm na ntangu ya kuvukisa ya 0,15 s. Nsemo ya ke pesa kikesa ke basikaka na nzila ya nsinga ya fibre optique na ngolo ya 90% na nzila ya kima mosi ya ke twadisaka DC2200 (Thorlabs Ltd., Royaume-Uni) mpi yo ke basikaka na kisina ya nsemo na angle ya90. Nsinga ya kutesila ke talana ti kitalatala sambu na kuvutula konso nsemo yina échantillon vandaka kubaka ve na luyantiku. Kutala mutindu ya kubaka masa 10 s na ntwala ya kupesa nsemo ya 50 s. Na nima, bo landaka diaka mutindu masa ke bakaka masa na nsungi ya 60 s na mpimpa sambu na kutadila kiteso yina quinolol ke kulumusaka na mutindu mosi ya kukonda kukana (tala kifwanisu S8 sambu na bansangu ya ntete).
Ba nsangu me salama na ku fwanana na ntalu ya luyantiku ya nzila mosi na kati ya 0,5 ti 10 s (na kutadila ntalu ya UQ2) mpe ku sala mwayene ya ntalu ya ba mbandu nyonso tatu na konso ntalu ya UQ2. Kuvukisa ya RC-LH1 yina ba me tanga na nzila ya mvingu ya bantu yina me fwanana, ba sadilaka yau samu na kubalula ntalu na ngolo ya mvingu ya bantu, yina me salama na nzila ya mvingu ya bantu, mpe me fwanana na mbandu ya Michaelis-Menten samu na kuzaba ntalu ya Km mpe Kcat yina ke monana.
Samu na ba nsangu ya mvingu ya bantu, ba nsangu ya RC-LH1 me fuluka na ~2μM na kati ya tampon ya IMAC yina kele na 50 mM ya mvingu ya bantu (Merck, États-Unis) mpe 0,4 mM ya mvingu ya bantu (Merck, États-Unis). Bau kesadilaka acide ascorbique mutindu ntuadisi ya ba électrons ya kimenga, mpe tert-butaclofène kesadilamaka mutindu ntuadisi ya QB samu na kuzaba ti ntuadisi ya nene ya RC kebikala ya kukulumuka (yina kele ve ya kukangama na nsemo) na ntangu nyonso ya kuteza. Kiteso ya 3 ml ya mbandu ke yikamaka na selile ya ke balukaka ya bo me yidika (kiteso ya 0,1 m na nene, 350 RPM) yina kele ti nda ya nzila ya optique ya 2 mm sambu na kuzikisa nde mbandu yina kele na nzila ya laser kele ti ntangu ya kufwana sambu na kuyikama na mpimpa na kati ya ba pulse ya kupesa kikesa. Sadila ~100-fs sambu na kukumisa ngolo ngidika ya laser Ti: Safire (Fiziki ya Spectra, États-Unis) sambu na kupesa kikesa na mbandu na 880 nm na vitesi ya mbala na mbala ya 1 kHz (20 nJ sambu na NIR to 100 nJ sambu na Vis). Na ntwala ya kuzwa bansangu, tula mbandu na nsemo ya ke pesa kikesa na kiteso ya miniti 30. Kumonisa ta sala nde QA kusala ve (ziku yo ta kulumusa QA mbala mosi to mbala zole). Kasi beno zaba ti nzila yayi lenda vutuka samu na manima ya ntangu ya yinda ya ku yidika mambu na mpimpa, RC ke vutuka malembe malembe na kisalu ya QA. Bo sadilaka kisadilu mosi (Systèmes ultra-rapides, États-Unis) sambu na kutesa bima yina ke manaka ve mpi yina ke vandaka ti ntangu ya retard ya -10 tii na 7000 ps . Sadila logiciel surface Xplorer ( Systèmes ultra rapide, États-Unis ) sambu na kukatula bansangu yina kele na kimvuka, na nima vukisa yo mpi sala nde yo vanda kiteso mosi. Sadila logiciel CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituanie) samu na kusadila kimvuka ya bansangu yina ba me vukisa samu na kuzwa ba nzila ya kuswaswana yina me tadila kubeba, to sadila kisalu yina ke vukisaka ba nzila mingi na mvutu ya kisadilu samu na kufwanana na ntungulu ya ba nzila ya nzila mosi na OriginLa (Origin, États-Unis).
Mutindu beto me tuba na zulu (53), bo yidikaka filme mosi ya ke salaka bima yina kele ti kimvuka ya LH1 yina kele ve ti antene ya RC mpi ya LH2 ya pene-pene. Bau tulaka nsinga yina na kati ya tris 20 mM (pH 8,0) mpe na manima bau tulaka yau na kati ya kitunga ya quartz yina kele na nzila ya kutala ya 2 mm. Bau sadilaka nsinga ya laser ya 30nJ sambu na kupesa kikesa na mbandu na 540 nm na ntangu ya kuvingila ya -10 tii na 7000 ps. Kusadila kimvuka ya bansangu mutindu bo me tubila yo sambu na Rps. pal mbandu.
150 000 RCF na nsungi ya bangunga 2 na 4°C, na nima bo vutulaka ngolo na yo na 880 nm na 20 mM ya tris-HCl (pH 8,0) mpi na 200 mM ya NaCl. Kuyoka mvingu ya bantu na kuyokaka malembe-malembe na 2% (p/v) ya β-DDM na ngunga 1 na mpimpa na 4°C. Bau tulaka ba mbandu na 100 mM ya pH 8,0 (TEAB; Merck, Royaume-Uni) tii na ntalu ya proteine ​​ya 2,5 mg ml-1 (analyse Bio-Rad). Bau salaka bisalu yankaka na nzila ya mutindu yina bau basisaka ntete (54), kubanda na kuyoka 50 μg ya proteine ​​na kati ya 50 μg ya TEAB yina kele na 1% (p/v) ya mvingu ya bantu (Merck, Royaume-Uni). Na nima ya kusadila sonika na nsungi ya 60 s, bo kulumusaka yo ti 5 mM ya tris (Merck, Royaume-Uni) na 37°C na nsungi ya miniti 30. Samu na S-alkylation, tula échantillon na kati ya 10 mM ya mvingu ya bantu (Merck, Royaume-Uni) mpe kuyika yau na nsadisa ya 200 mM ya mvingu ya bantu na miniti 10 na tiya ya kisika yina ba ke zingaka. Bau ke salaka kisalu ya kuyoka bima na nzila ya kuyika 2 μg ya masa ya kuvukisa ya trypsine/endoprotéine Lys-C (Promega UK) mpe kutula yau na 37°C na bangunga tatu. Bau katulaka mvingu ya bantu na nzila ya kuyika 50 μl ya mvingu ya bantu na 10 μl ya mvingu ya bantu (TFA; Kukabula ya ba fase me sadisama na nzila ya mvingu ya bantu na 15 700 RCF na miniti 5. Na kutadila mutindu yina muntu yina salaka yo vandaka kusadila, bo sadilaka kima mosi ( Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni ) sambu na kuyoka mpi kukatula mungwa na dikebi yonso na kitini ya nsi yina kele ti peptide. Na nima ya kuyuma na nzila ya mvingu ya bantu, bau tulaka mbandu na 0,5% ya TFA mpe 3% ya acétonitrile, mpe bau fimpaka 500 ng na nzila ya mvingu ya bantu na nzila ya mvingu ya bantu na nzila ya mvingu ya bantu na kusadilaka ba parametre ya ngidika yina beto tubilaka na ntwala.
Sadila MaxQuant v.1.5.3.30 (56) samu na kuzaba ba proteine ​​mpe kuzaba ntalu ya ba proteine ​​samu na kusosa Rps. nsangu ya ke tadila ba proteine ​​ya mfinda ( www. Ba nsangu ya ba nsangu ya spectrométrie ya masse me tulama na kimvuka ya ba nsangu na nzila ya kisika ya kubumba ba nsangu ya ba nduku ya PRIDE (http.
Samu na kufiongunina na nzila ya RPLC na nzila ya mvingu ya bantu, ba yidikaka kimvuka ya RC-LH1 na ba Rps ya mutindu ya mfinda. Na kusadilaka mutindu yina bo basisaka ntete (16), ntalu ya baproteine ​​yina bo basisaka na baselile ya lumba vandaka 2 mg ml-1 na kati ya Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM mpi 0,03% (p/v) ya DDM. Na kutadila mutindu ya kusadila yina muntu me sala, sadila kisadilu ya kusukula 2D (GE Healthcare, États-Unis) samu na kubasisa 10 μg ya proteine ​​na nzila ya mvingu ya bantu, mpe kuyoka mvingu ya bantu na 20 μl ya acide formique (FA), 20% (v/v) ya acétonitrile mpe 20% ya masa (v/v). Bau fimpaka ba microlitre tanu na nzila ya RPLC (Dionex RSLC) na nzila ya mvingu ya bantu (Maxis UHR-TOF, Bruker). Sadila ntungulu ya MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) samu na kukabula na 60°C mpe na 100μlmin -1, na zulu ya 85% (v/v) ya bima ya kuyoka A [0,1% (v/v) ya FA mpe 0,02% ya bima ya kuyoka na B5 [0,1%(v/v) ya FA mpe 0,02%(v/v) na 90%(v/v) ya TFA ya acetonitrile] Na kusadilaka kisina ya ionisation ya kura ya nsiku mpe ba parametre ya ntete na nsungi ya miniti kuluta 60, spectromètre ya masa ke bakaka 100 tii na 2750 m/z (kiteso ya masa na charge). Na lusadisu ya kisadilu FindPept (findPept) ya porte ya bima ya biolozi ya ExPASy, sala karte ya spectre ya masa na ba unités ya fioti ya kimvuka.
Bau ke kumisaka baselile yina nene na bangunga 72 na nsi ya nsemo ya NF ya fioti (10 ml), ya kati-kati (30 ml) to ya ngolo (300 ml). M22 (M22 yina bo ke katulaka masa ya amonium mpi bo ke yingisaka masa ya sodi) na kati ya mulangi ya 100 ml yina kele ti vis (23). Na ba cycle tanu ya 30-s, ba tulaka ba mbuma ya ditensi ya 0,1 micron na volime ya 1:1 samu na kuzenga ba cellule mpe kutula yau na madidi na zulu ya glace na miniti 5. Bau katulaka bima yina ke lembaka ve, baselile yina me bukana ve mpe ba mbuma ya ditensi na nzila ya kuyoka na 16 000 RCF na nsungi ya miniti 10 na kati ya kima mosi ya fioti yina kele na zulu ya banc. 100 000 RCF na 20 mM ya tris-HCl (pH 8,0) na 40/15% (p/p) ya sukadi na nsungi ya bangunga kumi.
Mutindu beto tubilaka yo na kisalu na beto ya ntama, kuzaba mambu yina ke salamaka na nitu ya muntu yina kele na PufW (16). Na bunkufi, kimvuka ya nsinga ya kuyobisa (11,8 nM) to nsinga ya kele ti ntalu ya RC ya kiteso mosi (yina bo ke zabaka na nzila ya oxidation yina ke katulaka spectre ya luswaswanu yina bo me kulumusa mpi ke wakana ti kizitu yina kele na zulu ya gel yina bo me tula mukubu) na kati ya tampon ya kutula bima ya SDS 2x (Merck, Royaume-Uni) yina bo me vukisa mbala zole. Bau kabulaka ba proteine ​​na zulu ya gel ya NuPage ya 12% ya bo me fwanisa. Bau tulaka mukubu na gel mosi na bleu brillant ya Coomassie (Bio-Rad, Royaume-Uni) sambu na kutula na zulu mpi kumona na mabanza kitini ya RC-L. Bau tulaka proteine ​​yina vandaka na zulu ya gel ya zole na zulu ya nsinga ya bo ke bingaka PVDF ( Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni ) sambu na kusala ekzame ya nitu. Bau kangaka nsinga ya PVDF na kati ya 50 mM ya tris-HCl (pH 7,6), 150 mM ya NaCl, 0,2% (v/v) ya fufu ya miliki ya kukonda mafuta, na nima bau tulaka yau na kati ya ntunga ya ntete ya anti-His (na tampon ya mH5 7,6), NaCl 150 mM mpi 0,05% (v/v) ya Tween-20] na kati ya 1:1000 A190-114A, Laboratoires de Béthyl, États-Unis) na nsungi ya bangunga 4. Na nima ya kuyobisa mbala tatu na nsungi ya miniti 5 na kati ya tampon ya anticorps, bo vukisaka membrane ti tampon ya anticorps ya zole (bo me vukisa yo 1:10 000 na tampon ya anticorps ya fioti) (Cyanagène, na Italie) mpi na zulu ya bifwanisu ya GE, na Royaume-Uni.
Na kusonga mutindu ya kukabula ngolo ya konso nzila ya gel to ya kukangama, kukotisa kisika yina kele na nsi ya nsongi mpi kutanga ntalu ya ngolo ya RC-L (gel ya kukangama) mpi ya Protéine-W (kukangama), na KifwanisuJ (57) Sadila kifwanisu. Bau balulaka ba ntalu yayi na ba ntalu ya molaire na kubanzaka ti ntalu ya RC-L na proteine-W na kati ya mbandu ya RC-LH114-W ya mpembe vuandaka 1:1 mpe bau tulaka na ndonga kimvuka ya bansangu nyonso na mutindu yina.
Sambu na kuzwa bima ya nkaka ya disolo yai, tala http://advances.sciencemag.org.
Yai kele disolo mosi ya bo me kabula na kulanda bansiku ya Nswa ya kupesa nswa ya kusala mambu. Disolo yango ke pesa nswa ya kusadila, kukabula mpi kubasisa yo na konso mutindu yina kukonda minsiku kana bo me tanga mbote-mbote mukanda ya kisina.
Noti: Beto ke lomba nge kaka na kupesa adresi na nge ya e-mail sambu muntu yina nge ke pesa zina na yandi na lutiti kuzaba nde nge ke zola nde yandi mona e-mail yina mpi nde yo kele ve e-mail ya mbi. Beto ta kanga ve ata adresi mosi ya ba e-mail.
Ngiufula yai ke sadisamaka sambu na kumeka kana nge kele munzenza mpi kukanga nzila na kutinda bansangu ya mbi na mbala mosi.
Davidi A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniele P Canniffe , Mark J.
Kusala ya ngolo ya kimvuka ya mutambu ya nsemo 1 na kati ya kisika ya kusala mambu kepesaka mayele ya mpa na yina metala mutindu quinone ketambulaka.
Davidi A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniele P Canniffe , Mark J.
Kusala ya ngolo ya kimvuka ya mutambu ya nsemo 1 na kati ya kisika ya kusala mambu kepesaka mayele ya mpa na yina metala mutindu quinone ketambulaka.
©2021 Kimvuka ya Amerika sambu na Kuyela ya Siansi. banswa yonso kele ya bo me bumba. AAAS kele nduku ya HINARI, AGORA, OARE, CHORALE, CLOCKSS, CroixRef mpi COMPTEUR. 2375-2548.